酶催化法在手性藥物合成與拆分中的應(yīng)用

林傳行 綜述，周寶寬 審校

（天津醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，天津300070）

2010年，在醫(yī)藥工業(yè)中，化學(xué)藥物銷售超過7000億美元，具有光學(xué)活性的手性藥物(chiral drug)約占全部化學(xué)藥40%～50%，規(guī)模約3200億美元[1]。而這一發(fā)展趨勢(shì)的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力來自于單一對(duì)映體手性藥物，因此，獲得單一對(duì)映體手性藥物成為關(guān)鍵。由于酶中心本身是一個(gè)不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，且有高選擇性，單一性強(qiáng)，產(chǎn)品光學(xué)純度高，能在溫和條件下高效、專一地催化各種生物化學(xué)反應(yīng)，因而，研究表明，酶催化法對(duì)手性藥物的合成與拆分是一種有效的方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 酶催化法對(duì)手性藥物的合成

酶催化法對(duì)手性藥物的合成就是以酶作催化劑合成高對(duì)映體過剩值(enantiomeric excess，ee）和好收率的單一對(duì)映體，即利用酶促反應(yīng)的高度立體、活性和區(qū)域選擇性將前體化合物不對(duì)稱合成各種復(fù)雜的手性化合物，該法反應(yīng)條件溫和、高效率、無毒性和環(huán)境污染，符合綠色化學(xué)。目前，該法在手性藥物合成中主要用于催化4種類型的反應(yīng)：不對(duì)稱還原；不對(duì)稱水解及其逆反應(yīng)；不對(duì)稱氧化；裂解反應(yīng)。

1.1 酶催化法的不對(duì)稱還原反應(yīng) 該法就是將分子中的酮基或碳碳雙鍵立體的還原產(chǎn)生特定結(jié)構(gòu)型化合物的反應(yīng)。劉湘等[2]研究了利用酵母細(xì)胞中所含的酶催化芳香酮的不對(duì)稱還原反應(yīng)，考察其產(chǎn)物(S)-1-苯基乙醇的對(duì)映性選擇的影響，同時(shí)他們還考察了芳香酮結(jié)構(gòu)對(duì)產(chǎn)物對(duì)映性的影響。Jing等[3]通過基因工程構(gòu)建重組菌的方法，克隆了來自擲孢酵母的醛還原酶基因，發(fā)現(xiàn)重組菌的酶活性是從擲孢酵母直接提取純化的酶的15倍。他們將重組酶用來不對(duì)稱還原4-氯-3-羰基乙酸乙酯（Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate,COBE），將其還原成（R）-或（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（Ethyl 4-chloro-3-hydroxy-butanoate，CHBE），顯然產(chǎn)率和ee值都有所提高，產(chǎn)率為98.5，ee值為99%。Rita等[4]利用源于超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的脫氫酶，以異丙醇為共底物，在40攝氏度條件下，并且以NADP(H)為輔助因子，催化苯乙酮得到ee值大于99.5%的(S)-醇。Asako等[5]研究了某種重組大腸桿菌中異源表達(dá)的青霉菌中的一種β-酮酯還原酶，命名為AKR3E1，發(fā)現(xiàn)這種異源表達(dá)的酶能立體選擇性還原4-溴-3-羰基甲基丁酸（Methyl 4-bromide-3-oxobutyrate, BAM）可以生成（S）-4-溴-3-羥基甲基丁酸，并且ee值比較高，達(dá)到97.9%。

1.2 酶催化法的不對(duì)稱水解 該法利用在水解酶的催化下，兩種對(duì)映異結(jié)構(gòu)體水解反應(yīng)的速度不同。目前大部分能夠催化不對(duì)稱水解反應(yīng)的都是水解酶，尤以不需輔酶的脂肪酶應(yīng)用廣泛。布洛芬是常用的抗炎鎮(zhèn)痛藥物，廣泛用于治療頭痛，據(jù)研究報(bào)道，消旋布洛芬的兩個(gè)對(duì)映體中（R）-對(duì)映體并無抗炎特性，而只有（S）-對(duì)映體具有抗炎的作用[6]。最近，Liu等[7]利用一種來自子囊菌酵母的胞外脂肪酶LIP，在0.1mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH值=8）中，催化水解（S）-布洛芬酯，得到了高純度的（S）-布洛芬，ee達(dá)到98%。Long等[8]通過基因工程的方法使粘質(zhì)沙雷菌ECU1010的一種脂肪酶在大腸桿菌中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)這種異源表達(dá)的脂肪酶能選擇性水解（R，S）-酮洛芬酯，將其水解成（S）-酮洛芬，ee值為91.6%，重組脂肪酶表現(xiàn)了比較高的立體選擇性，這給我們提供了另一條途徑去開發(fā)得到具有更高活性，立體選擇性更好的脂肪酶。Bae等[9]致力研究將（R，S）-氟比洛芬乙酯轉(zhuǎn)化成（S）-氟比洛芬，最終發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷菌ES-2的脂肪酶可以對(duì)其立體選擇性水解，并且ee值高達(dá)98.5%。由此可以表明酶催化法的不對(duì)稱水解在手性藥物獲得中有其重要作用，特別是脂肪酶的廣泛應(yīng)用。

1.3 酶催化法的不對(duì)稱氧化反應(yīng) 該法將分子內(nèi)的碳?xì)滏I或雙鍵立體選擇性氧化，產(chǎn)生特定構(gòu)型的羥基化合物或環(huán)氧化合物[10]。手性亞砜及其衍生物是重要的輔劑和手性配體、手性中間體以及手性藥物[11]。Vargas等[12]利用從真菌Caldariomyces fumago中分離出來的一種應(yīng)用非常廣泛的氯過氧化物酶，氧化一系列的β-羰基硫化物，條件是在檸檬酸鹽緩沖液（pH=5.0）和室溫條件下，結(jié)果得到了相應(yīng)的手性亞砜。（S）-（-）-4-溴-1，2-環(huán)氧丁烷和（R）-4-羥基-1，2-環(huán)氧丁烷，它們是合成某些抗真菌和抗焦慮藥物的重要中間體。近些年，有人利用甲烷單加氧酶的休止細(xì)胞催化相應(yīng)的烯烴環(huán)氧化制備得到了這些重要的中間體。同時(shí)他們利用ω-羥化酶合成β-阻斷劑類藥物Atenolo和Metopropol，先生成有效高對(duì)映體過量值的（S）型環(huán)氧手性骨架，然后再用化學(xué)方法進(jìn)一步加工修飾獲得最終產(chǎn)物。

1.4 酶催化法的裂解反應(yīng) 就是利用某些裂解酶的催化活性進(jìn)行手性分離。在自然界中羥基腈裂解酶可以催化腈醇的合成，Purkarthofer等[13]首次報(bào)道了酶催化的不對(duì)稱Henry反應(yīng)，而它們利用的正是這種酶，應(yīng)用于一系列的醛和硝基甲烷的Henry反應(yīng)。條件是以叔丁基甲基醚（TBME）和水兩相為反應(yīng)體系，在室溫下反應(yīng)，ee值高達(dá)99%，產(chǎn)率77%，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)反應(yīng)的產(chǎn)率和ee值的影響都比較顯著。此外，作者還研究了苯甲醛和硝基乙烷在羥基腈裂解酶作用下反應(yīng)，也取得了良好的效果，anti:syn可達(dá)9:1，anti異構(gòu)體的ee值可達(dá)95%。

2 酶催化法對(duì)手性藥物的拆分

主要是指利用酶的高度立體選擇性進(jìn)行消旋體的拆分，以獲得純的光學(xué)活性物質(zhì)，并且具有催化效率高，專一性強(qiáng)，產(chǎn)品光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 直接拆分外消旋體 即直接拆分法，通過酶催化法與對(duì)映異構(gòu)體反應(yīng)，生成非對(duì)映異構(gòu)體，利用它們之間各種性質(zhì)的差異，用非手性的方法將它們分離開來，最后分解所要的非對(duì)映異構(gòu)體得到需要的單一手性化合物。（S）-7-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-醇是合成對(duì)帕金森病有較好療效藥物的重要中間體，晁龍飛等[14]運(yùn)用化學(xué)方法合成了7-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-醇，并通過運(yùn)用生物酶催化法得到了手性化合物 (S)-7-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-醇，并篩選出了適合該體系的酶Novo2ym 435，而且還確定了最佳反應(yīng)時(shí)間為7.5h。徐剛等[15]在制備（S）-2-氯-1-（2-噻吩）-乙醇的過程中，通過對(duì)不同來源酶的篩選，最終找到了兩種選擇性較好的酶Alcaligenes sp和Novo2ym 435，有效拆分制備了（S）-2-氯-1-（2-噻吩）-乙醇，ee值達(dá)98.5%。

2.2 去消旋化法 也稱作對(duì)映體收斂轉(zhuǎn)化法，就是將外消旋體純化，利用酶催化反應(yīng)將一種對(duì)映體轉(zhuǎn)化成其對(duì)映異構(gòu)體，從而得到單一手性藥物[16]。隨著多相反應(yīng)器、酶固定化等新技術(shù)的日趨成熟，越來越多的酶已用于外消旋體的拆分[17]。Dunsmore等[18]利用某種有光學(xué)選擇性的胺環(huán)氧化酶，實(shí)現(xiàn)了手性胺的制備，該酶只氧化（S）-對(duì)映體為亞胺，而亞胺又可以被還原為外消旋胺，他們這樣重復(fù)操作，最終獲得了單一對(duì)映體，產(chǎn)率和ee值都很高。在仲醇去消旋化反應(yīng)的研究過程中，發(fā)現(xiàn)許多微生物系統(tǒng)中的醇類脫氫酶可以直接催化這類反應(yīng)，但去消旋化過程中一般有2種不同的具有對(duì)應(yīng)體選擇性的醇類脫氫酶的參與。Comasseto等[19]研究發(fā)現(xiàn)多種真菌，都能用于催化間位或鄰位氟苯1-乙醇發(fā)生去消旋化反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)率和對(duì)應(yīng)體過剩值都很高。2.3有機(jī)溶劑下酶法拆分 該方法區(qū)別于酶催化水解反應(yīng)，而是利用有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，克服了水為溶劑時(shí)酶回收問題。其中Zaks等[20]致力研究酶在有機(jī)溶劑媒介中的催化條件和特點(diǎn)及相關(guān)影響因素，發(fā)現(xiàn)以有機(jī)質(zhì)為溶劑具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值，并且酶更利于回收。Gill等[21]通過利用南極假絲酵母脂肪酶B（CALB），在以叔丁基甲基醚（TBME）作溶劑的條件下，拆分1-（3-溴）苯乙胺，底物的對(duì)映體過量值大于99%。2002年，Liu等[22]利用螢光假單胞桿菌脂肪酶水解法拆分乙?；?1，2-二醇和熒光假單胞桿菌脂肪酶在有機(jī)溶劑中通過?；ú鸱至艘阴；?1，2-二醇相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)酶的?；人夥磻?yīng)更有效，同時(shí)酰基化的不可逆性提高了光學(xué)純度。

2.4 酶膜法拆分 酶膜法就是先用酶水解底物，再利用膜的選擇透過性分離產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)分離一體化。最近，尚雁等[23]利用乳液酶膜反應(yīng)器（E-EMR）進(jìn)行外消旋萘普生甲酯的水解反應(yīng)，乳液酶膜反應(yīng)器是新型的酶膜反應(yīng)器；E-EMR為界面活性酶提供了良好的酶促拆分反應(yīng)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了ee值達(dá)到100%，獲得了光學(xué)純對(duì)映體（S）-萘普生。Ong等[24]通過研究，發(fā)現(xiàn)相比游離的南極假絲酵母脂肪酶B（CALB），如果將CALB固定于酶膜反應(yīng)器中，可以降低對(duì)映分離（R，S）-酮洛芬所需酶的量，同時(shí)ee值也有所提高，為87.8%。

3 手性藥物的酶催化不對(duì)稱定向合成技術(shù)的新進(jìn)展

近年來，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，特別是非水相酶促反應(yīng)的發(fā)展，利用酶和微生物進(jìn)行的手性化合物轉(zhuǎn)化和合成獲得的成功引起了有機(jī)化學(xué)家的極大關(guān)注。此外，超臨界流體技術(shù)的出現(xiàn)以及超臨界流體技術(shù)在酶催化反應(yīng)等領(lǐng)域的應(yīng)用也是一個(gè)發(fā)展方向，在許多情況下，酶催化反應(yīng)在有機(jī)溶劑中因反應(yīng)太慢而不能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。超臨界流體是指超過了物質(zhì)的臨界溫度和臨界壓力的流體，最常用的為超臨界CO2，它既具有與氣體相似的粘度，又兼有與液體密度相近的特性，是處于氣態(tài)和液態(tài)之間的中間狀態(tài)的物質(zhì)，因此它具有傳質(zhì)速率快，密度、介電常數(shù)等物理性質(zhì)對(duì)溫度和壓力變化敏感等優(yōu)點(diǎn)[25]。在超臨界流體中，由于它傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)速度得以大大加快，而且有機(jī)溶劑在超臨界液體中的溶解能力很好，在待拆分的消旋體中加入適量的手性識(shí)別劑，使其轉(zhuǎn)換成非對(duì)映體（一般情況下為非對(duì)映體鹽）。利用非對(duì)映體本身的溶解性差異以及它們?cè)诔R界流體中溶解性的差異使得消旋體更容易拆分，同時(shí)它的下游處理和溶劑回收也更加方便，對(duì)手性化合物的合成和外消旋體的拆分是一種很好的反應(yīng)體系[26]。

酶催化法對(duì)手性藥物的合成與拆分在手性藥物制備中已得到廣泛的應(yīng)用，主要是因?yàn)槊复呋Ⅲw選擇性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，成本低，且不會(huì)造成環(huán)境污染，從而利用酶催化法實(shí)現(xiàn)手性藥物的生物合成與拆分的發(fā)展前景良好。但如何制備得到相應(yīng)單一的酶，酶的回收以及如何使非水相拆分技術(shù)和超臨界流體技術(shù)能大規(guī)模地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)依然是一個(gè)尚待解決的問題。相信隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，酶催化法在手性藥物的合成與拆分上將得到更廣泛地應(yīng)用。

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