水稻中cry1Ah1基因密碼子優(yōu)化方案的比較

周宗梁，林智敏，耿麗麗，蘇軍，束長(zhǎng)龍，王鋒，朱延明，張杰

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

3 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003

自1996年美國(guó)孟山都公司成功商業(yè)化種植抗蟲棉以來，轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化已經(jīng)16年，至2011年年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.67億公頃[1]。國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻在研發(fā)方面已經(jīng)取得較大突破[2-4]，其中我國(guó)政府于2009年批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻商業(yè)化應(yīng)用生物安全證書，預(yù)示著轉(zhuǎn) Bt基因水稻等重要農(nóng)作物在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將發(fā)揮重要的作用。

1987年，Vaeck等在研究轉(zhuǎn)Bt基因煙草時(shí)發(fā)現(xiàn)野生型全長(zhǎng)cry1A (b) 基因轉(zhuǎn)化煙草后不表達(dá)，而改造后的基因在植株中卻具有一定的殺蟲活性[5]。究其根本原因是原核生物與真核生物基因存在很大的差別，例如：A/T (G/C) 含量和密碼子的使用頻率的差異，并且原核生物不具有真核生物基因中的5￠非翻譯區(qū)序列和3￠末端識(shí)別信號(hào)序列[6-7]，使很多來源于原核生物的基因在真核生物中直接表達(dá)時(shí)效率不高[8]。Wilbur等發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌與高等植物在密碼子的使用方面的差異[9]，Tohru Hayakawa等對(duì)cry4Aa基因改造時(shí)發(fā)現(xiàn)密碼子偏好性是影響基因表達(dá)的重要原因[10]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)生物體對(duì)同義密碼子的選擇不僅在基因表達(dá)水平方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，而且有利于提高翻譯的準(zhǔn)確性和效率[11-13]。

隨后人們發(fā)現(xiàn)影響外源基因表達(dá)水平的因素還有表達(dá)系統(tǒng) (啟動(dòng)子強(qiáng)度、載體性質(zhì)、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu))、外源基因結(jié)構(gòu) (終止密碼子)、表達(dá)條件等[14]。因此人們?cè)趯?duì)編碼區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的同時(shí)，提高基因的G+C含量[15]，改造造成表達(dá)量過低的一些不穩(wěn)定元件 (Instability elements)，包括類似植物內(nèi)含子的 A+T富含區(qū)[16]、潛在的植物 polyA 序列 (Polyadenylylationsignal sequences)[17]、對(duì)mRNA不穩(wěn)定有影響的ATTTA序列[15]以及植物少用或罕見的密碼子等，都是基因優(yōu)化改造的必要內(nèi)容。Koziel等在改造cry1Ab基因時(shí)，將GC含量由38%提高到65%，去除不穩(wěn)定元件后轉(zhuǎn)化玉米，發(fā)現(xiàn) Bt蛋白最高表達(dá)量占總可溶性蛋白的4%[18]。Perlak等改造cry1A (b) 和cry1A (c) 基因轉(zhuǎn)化番茄，發(fā)現(xiàn)改造后Bt殺蟲蛋白表達(dá)量提高10~100倍，最高表達(dá)量占總可溶性蛋白的 0.3%[19]。但目前對(duì)外源基因密碼子進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化、分析比較研究在國(guó)內(nèi)未見正式報(bào)道。

具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型Bt殺蟲基因-cry1Ah1[20]，其編碼的 Cry1Ah蛋白對(duì)棉鈴蟲Helicoverpa armigera、亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis和水稻二化螟Chilo suppressalis等多種鱗翅目害蟲具有很高的毒殺活性，超過目前商業(yè)化的cry1Ab、cry1Ac等基因，并明確了該基因的殺蟲活性區(qū)域在第28~640個(gè)氨基酸[21]。這將成為我國(guó)新一代抗蟲轉(zhuǎn)基因作物創(chuàng)制的重要保證。本研究根據(jù)水稻偏愛密碼子對(duì)cry1Ah1基因進(jìn)行了5種不同優(yōu)化，通過比較轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的差異，分析了不同優(yōu)化方案對(duì)基因表達(dá)的影響，獲得了最佳的優(yōu)化方案，此研究將為其他 Bt基因的優(yōu)化和轉(zhuǎn)基因植物的研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本文所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 材料和試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Ex Taq酶、M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。RNAprep pure Plant Kit植物總 RNA 提取純化試劑盒、RealMasterMix購(gòu)自天根公司。BCA Protein Assay Kit可溶性總蛋白定量試劑盒、包被液等ELISA所有試劑購(gòu)自康為公司。Cry1Ah抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

水稻日本晴Var Nippobare由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

小菜蛾P(guān)lutella xylostella由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組提供。水稻二化螟Chilo suppressalis由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻害蟲研究組提供。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司。多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Poten公司。核酸蛋白分析儀購(gòu)自美國(guó)Berkam公司。

1.2 方法

1.2.1 cry1Ah1基因的密碼子優(yōu)化

根據(jù) CUTG (Codon Usage Tabulated from GenBank) (http://www.kazusa.or.jp/codon/) 中水稻密碼子使用頻率表對(duì) cry1Ah1基因編碼區(qū)(64~1998 nt) 殺蟲關(guān)鍵區(qū)域[21]，在不改變?cè)?45個(gè)氨基酸序列前提下進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時(shí)綜合真核生物中影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及 mRNA穩(wěn)定性等因素，去除編碼區(qū)中的剪切信號(hào)以及常用的限制性酶切位點(diǎn)，起始密碼子前加入?序列[22]和 Kozak序列[23]，在雙終止子 (TGATGA)前加入KDEL序列[24]，經(jīng)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，改掉存在二級(jí)結(jié)構(gòu)臂或環(huán)上的錯(cuò)配堿基，去掉連續(xù)9個(gè)以上配對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)臂。優(yōu)化的基因由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的優(yōu)化后基因1 959 bp連接至pEB載體構(gòu)建pEB1Ah1質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3) 菌株[25]。

1.2.3 改造后基因的原核表達(dá)

表達(dá)菌株在IPTG終濃度為1 mmol/L，30 ℃、150 r/min的條件下誘導(dǎo)16 h[25]，SDS-PAGE分析可溶性與非可溶性蛋白，利用 MaBiophotonics Image J軟件對(duì)目的蛋白定量。

1.2.4 殺蟲活性測(cè)定

稱取3 g小菜蛾人工飼料 (本實(shí)驗(yàn)室制備)，將目的蛋白稀釋成5、50 μg/mL的濃度梯度拌入飼料，每個(gè)樣品梯度3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接30頭2齡敏感種群小菜蛾幼蟲，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，光照條件為12∶12 (L/D)，48 h后檢查活蟲數(shù)。

稱取 10 g水稻二化螟人工飼料 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻害蟲組提供)，將目的蛋白稀釋成5、50 μg/mL的濃度梯度拌入飼料，每個(gè)樣品梯度3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接30頭初孵敏感種群水稻二化螟幼蟲，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中 (保持黑暗)，7 d后檢查活蟲數(shù)。

1.2.5 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

水稻日本晴Var Nippobare的遺傳轉(zhuǎn)化由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。采用 Ubiquitin[26-27]為啟動(dòng)子的表達(dá)載體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法。五種方案優(yōu)化的基因采用同樣的啟動(dòng)子、載體和轉(zhuǎn)化方法 (圖1)。

1.2.6 PCR檢測(cè)

以 CTAB法[26]提取的水稻葉片基因組為模板，以非轉(zhuǎn)基因日本晴為陰性對(duì)照，利用表2引物對(duì)水稻抗性苗進(jìn)行目的基因和潮霉素抗性基因檢測(cè)。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300UAh示意圖Fig. 1 Construction of vector pCAMBIA1300Ah.

所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)

提取水稻葉片總RNA (步驟見植物總RNA提取純化試劑盒說明書)，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈 (步驟見反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)。利用表 3引物對(duì)采用四步法[28]以含內(nèi)參基因 actin (GenBank Accession No. NM_197297) 和優(yōu)化后基因重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)，內(nèi)參基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 2 min℃ ；94 ℃ 15 s，54 ℃ 15 s，68 ℃ 20 s，80 ℃ 6 s，plate read 40個(gè)循環(huán)，目的基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 2 min℃ ；94 ℃ 15 s，58 ℃15 s，68 ℃ 20 s；82 ℃ 6 s，plate read 40個(gè)循環(huán)。用IQ5軟件讀取數(shù)據(jù)。

表2 引物Table 2 The primers and their names

表3 引物Table 3 The primers and their names

1.2.8 BCA法測(cè)定可溶蛋白含量和ELISA間接法測(cè)定Cry1Ah蛋白含量

測(cè)定可溶性總蛋白濃度 (步驟見 BCA Protein Assay Kit試劑盒說明書)，建立可溶性總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中可溶性總蛋白濃度。采用ELISA間接法[26]測(cè)定Cry1Ah1標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品在450 nm處的吸光值，建立目的蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中目的蛋白的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 cry1Ah1基因的密碼子優(yōu)化和分析

五種方案 (方案一：將密碼子全部替換為每個(gè)氨基酸中的最高頻密碼子；方案二：只將稀有密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)樽罡哳l密碼子；方案三：按照密碼子頻率使用表中各密碼子使用頻率優(yōu)化；方案四：將序列中的密碼子換為中等頻率的密碼子；方案五：使用每個(gè)氨基酸最高頻的兩種密碼子)優(yōu)化后基因的GC含量提高到45.5%以上，同源性為 70.59%以上且更傾向于使用植物偏愛的密碼子。方案一優(yōu)化后的基因除個(gè)別剪切位點(diǎn)外全部采用最高頻率密碼子，GC含量最高，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，與原序列的堿基相似性最小(表4)。

2.2 改造后基因的原核表達(dá)分析

SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，非可溶組分中含有目的蛋白與預(yù)期大小相同，65 kDa條帶，與陽(yáng)性對(duì)照一致。而在可溶性組分中沒有該目的條帶。表明改造后的基因能在大腸桿菌 Rosetta (DE3) 中正常表達(dá) (圖2)。

2.3 生物活性測(cè)定

五種方案優(yōu)化后表達(dá)的目的蛋白濃度分別為0.60、0.90、0.360、0.30、0.48 μg/μL，野生型陽(yáng)性對(duì)照為3.36 μg/μL。對(duì)小菜蛾生物活性測(cè)定結(jié)果表明，目的蛋白濃度為50 μg/mL時(shí)校正死亡率為100%，陰性對(duì)照死亡率為10%；五種方案目的蛋白濃度在5 μg/mL下校正死亡率分別為37%、37%、40%、41%、33%，野生型陽(yáng)性對(duì)照的校正死亡率為52%，表明5種優(yōu)化后蛋白小菜蛾都具有一定的殺蟲活性。對(duì)水稻二化螟生物活性測(cè)定結(jié)果表明，5種方案目的蛋白濃度為50 μg/mL下死亡率為校正100%，陰性對(duì)照的死亡率為3%，5種方案蛋白在5 μg/mL濃度下的校正死亡率分別為22%、21%、27%、26%、24%，野生型陽(yáng)性對(duì)照的校正死亡率為32%，表明5種優(yōu)化后蛋白對(duì)水稻二化螟具有一定的殺蟲活性。生測(cè)結(jié)果說明由于基因優(yōu)化沒有改變氨基酸的序列，不同優(yōu)化的基因?qū)Π袠?biāo)害蟲殺蟲活性沒有顯著影響。

表4 cry1Ah1基因優(yōu)化前后物理參數(shù)的比較Table 4 Comparison of parameters of modified cry1Ah1 gene with wild type gene.

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻PCR鑒定

五種方案樣品PCR檢測(cè)抗性苗分別為25、35、29、39、28株。圖3為方案一樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均沒有條帶，樣品擴(kuò)增得到與陽(yáng)性對(duì)照相同大小的目的基因 497 bp和潮霉素基因 225 bp的條帶，PCR陽(yáng)性率為88%，其他4

種方案陽(yáng)性率分別為94%、93%、87%、93%。表明各方案 PCR陽(yáng)性率較高，轉(zhuǎn)化效率較高。

圖2 表達(dá)蛋白可溶組分 (A) 和非可溶組分 (B) 的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE of soluble and insoluble part. (A) M: protein marker; -: soluble part of pEB; +: soluble part of wild type; 1?5: soluble part of five program. (B) M: protein marker; -: insoluble part of pEB; +: insoluble part of wild type; 1?5: insoluble part of five program.

圖3 水稻基因組的PCR鑒定Fig. 3 Identification of rice genomic DNA by PCR. M: DNA marker; -: blank; CK: control; +: positive control; 1?21: sample.

2.5 SYBR green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR鑒定分析

內(nèi)參基因和目的基因的模板起始濃度的對(duì)數(shù)與模板CT值存在線性關(guān)系。圖4為方案一的內(nèi)參和目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。內(nèi)參基因的起始模板濃度的對(duì)數(shù)與CT值的相關(guān)系數(shù)為0.995＞r0.01=0.9172，達(dá)到了極顯著水平。目的基因的起始模板濃度的對(duì)數(shù)與CT值相關(guān)系數(shù)為0.993＞r0.01=0.9587，達(dá)到了極顯著水平。根據(jù)回歸方程計(jì)算出各方案目的基因/內(nèi)參基因即相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 內(nèi)參基因 (A) 和目的基因 (B) 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 Standard curve of actin (A) and target gene (B) between CT value and templates.

各方案中樣品的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差如圖5所示，其中方案一全部采用最優(yōu)密碼子的優(yōu)化方案的平均相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平高于其他方案，平均值為 0.273，方案三按照各密碼子頻率使用密碼子的優(yōu)化方案次之，平均值為 0.103 (圖5)。

2.6 ELISA間接法檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)含量

如圖6所示，光密度值與蛋白濃度存在線性關(guān)系。可溶性蛋白 BSA標(biāo)準(zhǔn)品含量與相應(yīng)的OD562值的相關(guān)系數(shù)為0.9999＞r0.01=0.87453，達(dá)到了極顯著水平。Cry1Ah1標(biāo)準(zhǔn)品含量與相應(yīng)的OD450值的相關(guān)系數(shù)為0.9383＞r0.01=0.87453，達(dá)到了極顯著水平。計(jì)算得出目的蛋白/可溶性總蛋白即相對(duì)蛋白含量 (%)。

圖5 改造后基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig. 5 Relative transcript level of modified genes.

圖6 可溶性總蛋白 (A) 和目的蛋白 (B) 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve of soluble protein (A) and target protein (B) between OD and protein concentration.

全部采用最優(yōu)密碼子的優(yōu)化方案相對(duì)蛋白含量?jī)?yōu)于其他方案，平均相對(duì)蛋白含量為0.104%，而方案三次之，平均相對(duì)蛋白含量為0.091%，各方案樣品間相對(duì)蛋白含量較穩(wěn)定(圖7)。

圖7 Cry1Ah1蛋白的平均相對(duì)蛋白含量Fig. 7 Relative protein content of Cry1Ah1.

3 討論

本研究根據(jù)水稻氨基酸密碼子的使用頻率對(duì)cry1Ah1基因殺蟲關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行5種不同的優(yōu)化，提高GC含量，去除內(nèi)含子剪切信號(hào)等不穩(wěn)定因素，并加以必要的修飾，轉(zhuǎn)化水稻日本晴后分子檢測(cè)得出全部采用最高頻率的密碼子優(yōu)化方案效果最好，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上比較了不同優(yōu)化方案之間的差別，并獲得最佳優(yōu)化方案，為 Bt等原核生物基因優(yōu)化和高效表達(dá)提供借鑒。為Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分析外源基因表達(dá)時(shí)，往往容易出現(xiàn)個(gè)別樣品在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平不一致的問題[29]，本實(shí)驗(yàn)中個(gè)別樣品也有此現(xiàn)象產(chǎn)生，分析原因可能是Real-time PCR的靈敏度要遠(yuǎn)高于ELISA，所以個(gè)別樣品的轉(zhuǎn)錄水平上的差距可能加大。同時(shí)密碼子只是決定基因表達(dá)水平高低的因素之一。翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)對(duì)基因的表達(dá)造成影響，本研究將各優(yōu)化基因的-4~+37翻譯起始區(qū)[30]的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能降到最低，分別為-3.23、-2.50、-1.44、-2.03、-3.23 kcal/mol，且沒有明顯差異，以排除翻譯起始區(qū)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能的較大差異對(duì)基因表達(dá)造成影響。此外Murray等發(fā)現(xiàn)在研究特異的密碼子偏性時(shí)，并不是所有的高表達(dá)基因 (如編碼核糖體蛋白和組蛋白的基因) 都有顯著的密碼子偏性[31]，說明真核生物中密碼子的偏性并不是由翻譯效率決定的，而可能是和基因組中的isochore結(jié)構(gòu)及含CG二核苷酸的密碼子使用有關(guān)。這些還有待今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。本研究從轉(zhuǎn)錄和翻譯等分子水平分析比較了各個(gè)優(yōu)化方案的差異，但是，由于轉(zhuǎn)基因植物耗時(shí)長(zhǎng)，工作量巨大，尚未積累足夠的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行溫室和田間抗蟲實(shí)驗(yàn)，這項(xiàng)工作也將在近期開展，完成后續(xù)的相關(guān)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

[1] Clive J. Global Status of Commercialized Biotech/ GM Crops. Ithaca: ISAAA, 2012, Brief No. 44.

[2] Cohen MB, Gould F, Bentur JS. Bt rice: practical steps to sustainable use. International Rice Research Notes, 2000, 25(2): 4–10.

[3] Ye GY, Shu QY, Yao HW, et al. Field evaluation of resistance of transgenic rice containing a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis berliner to two stem borers. J Econ Entomol, 2001, 94(1): 271–276.

[4] Qiu CX, Sangha JS, Song FS, et al. Production of marker-free transgenic rice expressing tissue-specific Bt gene. Plant Cell Rep, 2010, 29(10): 1097–1107.

[5] Vaeck M, Reynaerts A, H?fte H, et al. Transgenic plants protected from insect attack. Nature, 1987, 328(6125): 33–37.

[6] Lin YJ, Zhang QF. The transformation of synthetic Bacillus thuringiensis crystal protein gene of cry2A: China, ZL021390000. 2006-03-08.林擁軍, 張啟發(fā). 改造合成的蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因 cry2A: 中國(guó), ZL02139000. 2006-03-08.

[7] Leigh H, Susan M, James W, et al. Nucleic acid segments encoding modified Bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins: US, 6060594. 2000-05-09.

[8] Mittler IJ, Plaisted DC, Honghton W, et al. DNA construct containing Bacillus thuringiensis gene and plants containing it: US, 6342660 B1. 2002-01-29.

[9] Campbell WH, Gowri G. Codon usage in higher plants, green algae, and cyanobacteria. Plant Physiol, 1990, 92(1): 1–11.

[10] Hayakawa T, Howlader MTH, Yamagiwa M, et al. Design and construction of a synthetic Bacillus thuringiensis cry4Aa gene: hyperexpression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80(6): 1033–1037.

[11] Zhang L, Jin LG, Luo L, et al. Analysis of nuclear gene codon bias on soybean genome and transcriptome. Acta Agronom Sin, 2011, 37(6): 965–974.張樂, 金龍國(guó), 羅玲, 等. 大豆基因組和轉(zhuǎn)錄組的核基因密碼子使用偏好性分析. 作物學(xué)報(bào), 2011, 37(6): 965–974.

[12] Li CL, Han L, Zheng ZY, et al. Optimization of plant des-pGlu1-Brazzein gene according to yeasty biased codons and its expression in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2011, 27(8): 1158–1163.李春麗, 韓露, 鄭振宇, 等. 植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的密碼子優(yōu)化及其在畢氏酵母中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(8): 1158–1163.

[13] Yang JK, Yan XX, Huang RB, et al. Codon optimization, expression and enzymatic comparison of Rhizopus oryzae lipases pro-ROL and m-ROL in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2011, 27(12): 1780–1788.楊江科, 嚴(yán)翔翔, 黃日波, 等. 米根霉脂肪酶基因pro-ROL和m-ROL在畢赤酵母中的密碼子優(yōu)化、表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的比較分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(12): 1780–1788.

[14] Yin CG, Du LX, Zhao GP, et al. Optimizing the expression of Mx gene in Escherichia coli based on rare codon and mRNA structure. Hereditas, 2009, 31(1): 75–82.尹春光, 杜立新, 趙桂平, 等. Mx基因稀有密碼子和 mRNA結(jié)構(gòu)及大腸桿菌表達(dá)優(yōu)化. 遺傳, 2009, 31(1): 75–82.

[15] Nicolai S, Aviah Z, Menachem K, et al. Synthetic Bacillus thuringiensis cryiC gene encoding insect toxin: US, 6043415. 2000-3-28.

[16] Goodall GJ, Filipowicz W. The AU-rich sequences present in the introns of plant nuclear pre-mRNAs are required for splicing. Cell, 1989, 58(3): 473–483.

[17] Dean C, Tamaki S, Dunsmuir P, et al. mRNA transcripts of several plant genes are polyadenylated at multiple sites in vivo. Nucl Acids Res, 1986, 14(5): 2229–2240.

[18] Koziel MG, Beland GL, Bowman C, et al. Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Nat Biotechnol, 1993, 11(2): 194–200.

[19] Perlak FJ, Fuchs RL, Dean DA, et al. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(8): 3324–3328.

[20] Zhang J, Song FP, Huang DF, et al. Bt-cry1Ah gene with high toxicity for lepidoptera and its expression product: China, ZL200410009918.9. 2005-05-11.張杰, 宋福平, 黃大昉, 等. 對(duì)鱗翅目昆蟲高毒力的 Bt cry1Ah基因及其表達(dá)產(chǎn)物: 中國(guó), ZL200410009918.9. 2005-05-11.

[21] Xue J, Zhou ZS, Song FP, et al. Identification of the minimal active fragment of the Cry1Ah toxin. Biotechnol Lett, 2011, 33(3): 531–537.

[22] Gallie DR, Sleat DE, Watts JW, et al. The 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo. Nucl Acids Res, 1987, 15(8): 3257–3273.

[23] Kozak M. Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs. Nucl Acids Res, 1984, 12(2): 857–872.

[24] Wandelt CI, Khan MRI, Craig S, et al. Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants. Plant J, 1992, 2(2): 181–192.

[25] Zhang JT, Shu CL, Song FP, et al. Cloning, expression and insecticidal activity of cry2Ad gene from Bacillus thuringiensis. Biotechnol Bull, 2009, (10): 146–150, 155.張靜濤, 束長(zhǎng)龍, 宋福平, 等. 蘇云金芽胞桿菌cry2Ad基因的克隆及其表達(dá)產(chǎn)物的活性分析. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, (10): 146–150, 155.

[26] Wang GL, Fang HJ. Plant Genetic Engineering. 2nd ed. Beijing: Science Press, 2002: 744.王關(guān)林, 方宏筠. 植物基因工程. 2版. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 744.

[27] Christensen AH, Quail PH. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res, 1996, 5(3): 213–218.

[28] Zhang CY, Zhang GH, Yang M, et al. Elimination of primer-dimer effect in SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR using 4-step program. Chin J Biochem Mol Biol, 2004, 20(3): 387–392.張馳宇, 張高紅, 楊敏, 等. 四步法消除 SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)定量RT-PCR中引物二聚體的影響.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2004, 20(3): 387–392.

[29] Hiwasa-Tanase K, Nyarubona M, Hirai T, et al. High-level accumulation of recombinant miraculin protein in transgenic tomatoes expressing a synthetic miraculin gene with optimized codon usage terminated by the native miraculin terminator. Plant Cell Rep, 2011, 30(1): 113–124.

[30] Kudla G, Murray AW, Tollervey D, et al. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science, 2009, 324(5924): 255–258.

[31] Murray EE, Lotzer J, Eberle M. Codon usage in plant genes. Nucl Acids Res, 1989, 17(2): 477–498.