進(jìn)化代謝選育高滲透壓耐受型產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌

張常青，茍冬梅，梅佳軍，劉嶸明，馬江鋒，陳可泉，朱建國,2，姜岷

1 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816

2 常茂生物化學(xué)工程股份有限公司博士后科研工作站，江蘇 常州 213034

琥珀酸又名丁二酸，是一種較為常見的有機(jī)酸，是TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物以及厭氧碳代謝過程的終端還原產(chǎn)物。琥珀酸作為一種四碳二元羧酸，廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、制造業(yè)等各個領(lǐng)域[1]。

相對于化學(xué)合成法，生物合成琥珀酸是利用細(xì)菌、真菌等各種微生物，以葡萄糖或其他各種水解液為碳源，經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，其最大優(yōu)勢是原材料為可再生資源，并且具有消耗低、污染小、反應(yīng)溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此生物法合成琥珀酸成為近年來研究的熱點(diǎn)[2-3]。

鈉離子是維持細(xì)胞各項生理特性的最重要的離子之一[4]，對菌體細(xì)胞的生長[5]、ATP的生成[6]、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及擴(kuò)散[7]、胞內(nèi) pH的調(diào)控[8]、基因轉(zhuǎn)錄[9]等都有一定的影響。對許多產(chǎn)琥珀酸菌體，當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏Na+時，會使菌株對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)造成不良的影響[10]，使得菌體無法正常代謝生長。然而當(dāng)Na+濃度較高時，由于Na+的積累造成的滲透壓升高，對菌體的生長代謝造成不利的影響[11-12]。Lee等[13]曾報道，在產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens發(fā)酵過程中，當(dāng)NaCl的濃度高于4 g/L時，菌體的生長以及產(chǎn)酸都受到抑制。Fang等[14]和徐敏等[15]曾報道通過篩選高濃度NaCl耐受性菌株，提高產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes對滲透壓的耐受性，從而提高琥珀酸的產(chǎn)量。

在以NaOH和Na2CO3為酸中和劑進(jìn)行的大腸桿菌 AFP111兩階段發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的過程中，會有大量的Na+積累，從而導(dǎo)致體系中滲透壓升高，從而嚴(yán)重抑制菌體的生長以及產(chǎn)酸。因此，選育一株具有高滲透壓耐受型琥珀酸生產(chǎn)菌株顯得尤為重要。

進(jìn)化代謝是以一定的選擇性壓力為手段，利用菌體對環(huán)境的自適應(yīng)機(jī)制，從細(xì)胞庫中篩選出所需要的表型突變，使菌體選擇性進(jìn)化的方法[16]。進(jìn)化代謝是一種非常高效的菌株篩選方法，它在生物進(jìn)化研究和菌株選育中具有廣泛的應(yīng)用。利用基因組學(xué)與進(jìn)化代謝技術(shù)相結(jié)合的方法，可以直觀地了解到變異菌體整個基因組的變化，在菌體適應(yīng)性進(jìn)化的動力學(xué)和基因?qū)W基礎(chǔ)方面也獲得了巨大的成功[17-18]，這對于研究生物進(jìn)化是一種里程碑式的突破。因?yàn)榧?xì)菌具有數(shù)量大，傳代速度快，并且可以適應(yīng)一定環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，因此對于可以適應(yīng)選擇性壓力的菌體，能夠快速地適應(yīng)外界環(huán)境并達(dá)到穩(wěn)定的生長狀態(tài)，從而在進(jìn)化代謝的過程中獲得生長優(yōu)勢，對于那些不能快速適應(yīng)環(huán)境的菌體，由于其生長速度慢，則很快被優(yōu)勢菌體淘汰[17,19-20]。進(jìn)化代謝方法主要用于以下幾個方面的菌株選育，一是選擇能夠抵抗某種底物或產(chǎn)物壓力的高抗逆菌株，如改善產(chǎn)琥珀酸放線桿菌在琥珀酸生產(chǎn)中銨根離子的抑制[21-22]，二是選擇可以高效利用某些底物的菌株，如改善菌體對某些糖的利用效率[23-27]。三是選育可以高效生產(chǎn)某一特定產(chǎn)物的菌體[28-29]。本研究以NaCl為滲透壓調(diào)節(jié)劑，大腸桿菌AFP111為出發(fā)菌株，通過不斷提高選擇性培養(yǎng)基中NaCl的濃度，最終得到了一株高滲透壓耐受型琥珀酸生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌 Escherichia coli AFP111 [F+ λrpoS396 (Am) rph-1 △(pflAB::Cam) ldhA::Kan 95 ptsG]，由David P. Clark 教授 (Southern Illinois University) 惠贈。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，卡那霉素30 mg/L，氯霉素30 mg/L，過濾除菌后加入。

1.2.2 篩選平板培養(yǎng)基

在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入NaCl調(diào)節(jié)其最終濃度為0.2~0.8 mol/L，瓊脂1.5%~2.0%。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

檸檬酸 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，KH2PO48 g/L，(NH4)2HPO48 g/L，NH4Cl 0.2 g/L，(NH4)2SO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·2H2O 10 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.5 mg/L，CuCl2·2H2O 0.25 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.75 mg/L，H3BO30.12 mg/L，Al2(SO4)31.77 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵16.1 mg/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；維生素B120 mg/L，生物素2 mg/L，卡那霉素30 mg/L，氯霉素30 mg/L，過濾除菌后加入。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵用培養(yǎng)基

30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基 (如1.2.3)，添加0.48 g堿式碳酸鎂，30 g/L葡萄糖。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將保存于-80 ℃凍存管中的菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為 5 mL的試管中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)作為一級種子。將試管中的一級種子，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為100 mL的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h，作為二級種子。

1.3.2 兩階段搖瓶發(fā)酵

將二級種子培養(yǎng)的細(xì)胞8 000 r/min、4 ℃離心10 min，然后用30 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基將細(xì)胞重新懸浮到 100 mL厭氧血清瓶中，通無菌CO22 min以維持厭氧環(huán)境，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。

1.3.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，在7 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter；New Brunswick ScientificCo.，Edison，N.J.) 中進(jìn)行兩階段發(fā)酵，裝液量3 L，接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃。在菌體有氧生長階段，初始糖濃度為 15 g/L。當(dāng)菌體濃度達(dá)到 OD600=15時，此時發(fā)酵罐中葡萄糖已經(jīng)耗盡，流加600 g/L的葡萄糖，控制菌體比生長速率為0.7 h-1，有氧階段，20% NaOH控制pH 6.8。當(dāng)菌體密度達(dá)到 OD600=30，通入無菌過濾的 CO2轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵，通氣量為 0.5 L/min，并改用 25% Na2CO3調(diào)節(jié)pH為6.4。流加補(bǔ)充葡萄糖，維持葡萄糖濃度在10 g/L左右[30-31]。

1.3.4 進(jìn)化代謝選育

以一個自主設(shè)計的500 mL五口燒瓶作為進(jìn)化代謝的反應(yīng)器，裝液量為200 mL，接種量為1%。水浴加熱維持37 ℃，200 r/min磁力攪拌，0.5 L/min通入無菌空氣，20% Na2CO3控制pH為 6.8。通過蠕動泵不斷泵入新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)反應(yīng)器中菌液體積超出200 mL時，將自動被空氣壓出?？刂品磻?yīng)器中最初的稀釋速率為0.02 h-1，當(dāng)在一定的NaCl條件下，菌體密度和耗糖保持3個保留時間不變，則提高稀釋速率到0.04 h-1，直至稀釋速率達(dá)到0.153 h-1。新鮮培養(yǎng)基中NaCl的最初濃度為0.4 mol/L，逐漸增加至0.8 mol/L。在每次提高新鮮培養(yǎng)基中NaCl的濃度之前，從反應(yīng)器中取樣稀釋1×104倍涂布在相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基平板上。

1.3.5 突變株的篩選

將進(jìn)化代謝裝置選育的突變株在篩選平板上多次傳代培養(yǎng)，挑選生長性能穩(wěn)定、生長迅速的菌株進(jìn)行兩階段搖瓶發(fā)酵，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，HPLC檢測各菌株發(fā)酵性能。

1.3.6 分析檢測

菌體密度測定：紫外可見分光光度計(Spectrumlab 752S)，于600 nm處測定吸光值。

葡萄糖濃度測定：生物傳感分析儀(SBA240C，山東省科學(xué)院生物研究所)。

發(fā)酵液中有機(jī)酸的測定[32]：用高效液相色譜法 (HPLC) 檢測，色譜柱為 Prevail Organic Acid，流動相為25 mmol/L KH2PO4，pH 2.5，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長215 nm。

2 結(jié)果

2.1 滲透壓對Escherichia coli AFP111產(chǎn)琥珀酸的影響

以NaCl為滲透壓調(diào)節(jié)劑，考察了滲透壓對E. coli AFP111生長性能和產(chǎn)酸的影響。由圖1可知，在較低的NaCl濃度下，菌體的生長以及產(chǎn)酸受到的影響較小。然而，當(dāng)培養(yǎng)基中 NaCl濃度超過0.4 mol/L時，菌體的生長明顯受到影響，繼續(xù)增加NaCl的濃度，則菌體生長嚴(yán)重被抑制，琥珀酸的產(chǎn)量也嚴(yán)重下降，尤其當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度達(dá)到0.6 mol/L時，琥珀酸的產(chǎn)量僅有4.3 g/L。該結(jié)果說明滲透壓對E. coli AFP111的生長以及產(chǎn)酸具有很大的影響，在高滲透壓條件下，菌體的生長以及產(chǎn)酸都受到嚴(yán)重的抑制。因此，選育一株高滲透壓耐受性并且高產(chǎn)琥珀酸的菌株是很有必要的。

圖1 滲透壓對菌體生長 (A) 和琥珀酸生產(chǎn)的影響 (B)Fig. 1 Effect of osmotic stress on cell growth (A) and succinic acid production by E. coli AFP111 (B). (A) The growth curve of E. coli AFP111 was measured under aerobic condition in LB media supplemented with different concentrations of NaCl. (B) Dual-phase fermentations of E. coli AFP111 after 48 h anaerobic fermentation supplemented with different concentrations of NaCl.

2.2 進(jìn)化代謝系統(tǒng)的設(shè)計與操作

進(jìn)化代謝育種系統(tǒng)是一個連續(xù)培養(yǎng)裝置，通過不斷補(bǔ)加含有高濃度NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基并逐步提高NaCl的濃度篩選耐高滲透壓生產(chǎn)菌株。由圖2可知，在504 h處，補(bǔ)料培養(yǎng)基中NaCl的濃度達(dá)到了 0.8 mol/L，稀釋速率維持在0.153 h-1，該菌體密度的增加以及葡萄糖的消耗速率維持時間多于3個保留時間[21,33]，表明菌體已經(jīng)利用對環(huán)境的自適應(yīng)機(jī)制，從細(xì)胞庫中篩選出能所需要的表型突變，在高滲透壓條件下進(jìn)化代謝得到所需菌株，使其可以在高滲透壓條件下快速生長。

圖2 連續(xù)培養(yǎng)操作過程Fig. 2 The operational process of adaptive evolution.

2.3 突變菌株的篩選

進(jìn)化代謝系統(tǒng)中菌體密度升高以及殘?zhí)堑南陆当砻髁四透邼B透壓突變株已傳代生長。從反應(yīng)器中取適量菌體，涂布在含有 0.4~0.8 mol/L NaCl的篩選平板培養(yǎng)基中多次傳代培養(yǎng)。選擇菌體生長速度快，菌落直徑較大的菌株進(jìn)行兩階段搖瓶發(fā)酵。最終篩選到6株產(chǎn)酸性能較好的菌株XB1、XB2、XB3、XB4、XB5、XB6，其兩階段發(fā)酵厭氧階段的產(chǎn)酸情況見表1。

表1 突變菌株與出發(fā)菌株AFP111產(chǎn)酸效果對比aTable 1 Succinic acid production in AFP111 compared with XB4a

由表1可以看出在0.4 mol/L NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，出發(fā)菌株AFP111的產(chǎn)酸明顯受到抑制，琥珀酸的產(chǎn)量明顯降低，并且菌體衰亡很快，而突變菌株的發(fā)酵性能在高濃度 NaCl中明顯改善，琥珀酸的產(chǎn)量和收率都明顯高于出發(fā)菌株，菌體的 OD600也要高于出發(fā)菌株。其中突變株XB4琥珀酸產(chǎn)量為23.7 g/L，比出發(fā)菌株提高了56%，基本達(dá)到了出發(fā)菌株在未添加NaCl的培養(yǎng)基中的產(chǎn)量 (24.5 g/L)，琥珀酸相對于葡萄糖的收率為92%，也高于出發(fā)菌株的86%。

2.4 突變株XB4和出發(fā)菌株AFP111在不同濃度NaCl條件下的產(chǎn)酸效果對比

分別將突變株XB4和出發(fā)菌株AFP111在含有不同濃度NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行兩階段搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示。

由圖 3可知，在兩階段搖瓶發(fā)酵過程中，NaCl的濃度對菌體的發(fā)酵產(chǎn)酸具有很大的影響。然而由高濃度 NaCl造成的高滲透壓，突變株XB4與出發(fā)菌株AFP111相比，耐受性有了明顯改善，尤其是當(dāng)培養(yǎng)基中Na+的濃度大于0.6 mol/L時，突變株在產(chǎn)酸方面的優(yōu)勢更加明顯。

圖3 突變菌株XB4和出發(fā)菌株AFP111在不同NaCl濃度下產(chǎn)酸效果對比Fig. 3 Effect of different concentration of NaCl on succinic acid production in AFP111 compared with XB4.

2.5 突變菌株與出發(fā)菌株在發(fā)酵罐中的兩階段分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果對比

圖4 突變株XB4兩階段發(fā)酵菌體生長以及產(chǎn)酸結(jié)果Fig. 4 Time course of cell growth and production of organic acids in the dual-phase fermentation by XB4.

根據(jù)兩階段搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇 XB4作為最佳耐高滲透壓生產(chǎn)菌株，并在7 L發(fā)酵罐中對XB4進(jìn)行兩階段發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，對照菌的發(fā)酵過程曲線如圖5所示。在菌體厭氧發(fā)酵階段，琥珀酸在發(fā)酵液中積累，需要大量的 Na2CO3中和產(chǎn)生的有機(jī)酸，從而導(dǎo)致Na+大量積累，產(chǎn)生較高的滲透壓，對菌體的活力以及產(chǎn)酸造成不良的影響。而突變株 XB4由于對由Na+產(chǎn)生的高滲透壓具有很高的耐受性，因此在相同的條件下突變株 XB4發(fā)酵性能比出發(fā)菌株AFP111有了很大的提高。由表2可知，突變株XB4在兩階段培養(yǎng)條件下，厭氧發(fā)酵60 h，最終的琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到了69.5 g/L，琥珀酸生產(chǎn)速率達(dá)到了 1.18 g/(L·h)，分別比出發(fā)菌株AFP111提高了18.6%和20%。

圖5 E. coli AFP111兩階段發(fā)酵菌體生長以及產(chǎn)酸結(jié)果Fig. 5 Time course of cell growth and production of organic acids in the dual-phase fermentation by E.coli AFP11.

表2 大腸桿菌AFP111與突變株XB4兩階段發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸結(jié)果對比Table 2 Succinic acid production in AFP111 compared with XB4 during dual-phase fermentation.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用進(jìn)化代謝育種方法，通過在高滲透壓條件下對菌體進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，在高濃度NaCl梯度平板對突變菌株進(jìn)行初篩，然后厭氧血清瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終選到一株能夠耐受 0.8 mol/L NaCl的突變株XB4。在以NaOH和Na2CO3為酸中和劑的兩階段發(fā)酵中，該突變株厭氧60 h產(chǎn)琥珀酸 69.5 g/L，琥珀酸生產(chǎn)速率達(dá)到了1.81 g/(L·h)，分別比出發(fā)菌株 AFP111提高了18.6%和20%。

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