RP-HPLC法測(cè)定天山雪蓮口服液中綠原酸及蘆丁

賈麗華， 凱賽爾·阿不拉

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830002;2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830004)

天山雪蓮口服液是以菊科風(fēng)毛菊屬植物天山雪蓮(Sau-ssurea involucrataKar.et Kir.)Sch.-Bp.為原料，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)研制而成的純天然單味口服制劑。本品收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》經(jīng)絡(luò)肢體腦系分冊(cè)［1］，其測(cè)定方法為以蘆丁作對(duì)照，用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮量，缺乏專屬性。文獻(xiàn)報(bào)道天山雪蓮中的紫丁香苷為其有效成分之一，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.232 mg/g［2］。曾經(jīng)采用高效液相色譜法，對(duì)天山雪蓮口服液中紫丁香苷的測(cè)定進(jìn)行了研究，以進(jìn)一步探索專屬性較強(qiáng)的質(zhì)量控制方法。然而天山雪蓮口服液中紫丁香苷量較低，平均每1 mL 含0.03 mg［3］，不適宜作含測(cè)指標(biāo)。天山雪蓮藥材主要含蘆丁、槲皮素、高車前素、柯伊利素、木犀草素等黃酮類，大苞雪蓮堿等倍半萜內(nèi)酯類，揮發(fā)油類，還有綠原酸、紫丁香苷、多糖等成分［2-9］。高車前素、柯衣利素及大苞雪蓮堿等無對(duì)照品可供用于測(cè)定。天山雪蓮藥材中綠原酸及蘆丁的定量測(cè)定已收載于《中國(guó)藥典》2005年版一部［5-6］，為保證天山雪蓮口服液質(zhì)量的可控性，采用HPLC法對(duì)其所含成分綠原酸和蘆丁同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，可用于天山雪蓮口服液的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters 1525雙元高壓泵，Waters 2487雙通道紫外檢測(cè)器，Waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器，Brezee色譜工作站;BP211D電子天平(賽多利斯公司);KLZ-UP高端超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠)。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110753-200212供含量測(cè)定用)。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):0880-9705供定量測(cè)定用)。甲醇為色譜純(Fisher公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。天山雪蓮口服液(新疆天山雪蓮制藥有限公司，批號(hào)20040208， 20040628， 20040804， 20040921， 20050606，20050711，20050824，20050930)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry shieldTMRP18(4.6 mm ×150 mm，5 μm，Ireland);以乙腈為流動(dòng)相 A，0.4% 磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫;體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm［5］;進(jìn)樣:10 μL 測(cè)定。在以上色譜條件下，與其它組分分離度良好，見色譜圖1。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁，和綠原酸對(duì)照品各適量，加50%甲醇制成每1 mL含蘆丁100 μg、綠原酸40 μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品10 mL，置25 mL

量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為供試品溶液。

圖1 綠原酸及蘆丁對(duì)照品(A)和樣品(B)HPLC色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對(duì)照品10.19 mg及120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.56 mg，置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇適量溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含綠原酸1.019 mg及蘆丁1.056 mg的貯備液，精密吸取此貯備液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，制成每 1 mL 含綠原酸0.010 19、0.020 38、0.040 76、0.061 14、0.081 52、0.101 9、0.122 28、0.142 66 mg 及蘆丁 0.010 56、0.021 12、0.042 24、0.063 36、0.084 48、0.105 6、0.126 72、0.147 84 mg的系列濃度對(duì)照品溶液，分別進(jìn)10 μL，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積的積分值Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。各組分回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn) 取綠原酸與蘆丁混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸的 RSD為0.34%，蘆丁的RSD為0.16%，顯示精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品(20050930)，按2.3項(xiàng)下的方法分別制備6份供試品溶液，按測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果綠原酸，蘆丁質(zhì)量濃度分別為 0.106 mg/mL，0.289 mg/mL，RSD分別為1.66%，1.73%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(20050930)，分別放置 0、4、8、12、16 h 后進(jìn)樣，每次 10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸和蘆丁RSD分別為1.23%、0.14%。表明供試品溶液室溫在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的(20050930)樣品共9份5.0 mL，每份按高、中、低分別加入各對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下操作，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.9 樣品測(cè)定 取8批天山雪蓮口服液，按2.3項(xiàng)下的樣品處理方法及2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每批樣品平行制備2份，每份進(jìn)樣2次，每次進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=4)

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)曾參考中國(guó)藥典2005年版一部天山雪蓮藥材［5］項(xiàng)下HPLC中的流動(dòng)相系統(tǒng)，不能同時(shí)滿足蘆丁和綠原酸的分離，而在本實(shí)驗(yàn)條件下綠原酸和蘆丁的分離度良好。

3.2 流動(dòng)相選擇試驗(yàn)中比較了甲醇-0.4% 磷酸溶液(38∶62，35 ∶65)，乙腈-0.4% 磷酸溶液(13 ∶87，15 ∶85)等，發(fā)現(xiàn)綠原酸、蘆丁和相鄰雜質(zhì)分離度不佳，以乙腈-0.4% 磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，達(dá)到完全分離。因此最終確定進(jìn)行梯度洗脫。

［1］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局編.國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編.經(jīng)絡(luò)肢體腦系分冊(cè)［S］.2002:560-563.

［2］俞敏倩，陳建民.高效液相色譜法測(cè)定11種雪蓮花中蘆丁及紫丁香苷［J］.色譜，2001，19(3):243-244.

［3］凱賽爾·阿不拉，蘇來曼·哈力克，王新宇.HPLC測(cè)定雪蓮口服液中紫丁香苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(22):1895-1897.

［4］李君山，蔡少青.雪蓮花類藥材的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1998，33(8):449-452.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2005年版一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:36-37.

［6］蘇來曼·哈力克，凱賽爾·阿不拉.RP-HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地不同采集期天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量［J］.中草藥，2007，38(9):1412-1414.

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［10］陳發(fā)奎主編.中藥有效成分含量測(cè)定［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:11.

［11］劉曉秋主編.中成藥分析實(shí)驗(yàn)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2006.