佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及成纖維樣滑膜細胞的分離

張巍，王芳，王博，張瑾，張曉郡，閻瑾琦，徐元基，王啟宇，于繼云

(軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究室，北京 100850)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，主要侵犯活動關(guān)節(jié)的滑膜，導(dǎo)致滑膜過度增殖以及軟骨和骨破壞，致殘率高，嚴重影響病人的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命，一直是世界范圍內(nèi)的研究熱點［1］。目前關(guān)于RA 致病因素及發(fā)病機制有很多假說，但尚未完全清楚，為更好地研究RA 發(fā)病機制及篩選有效治療藥物，制備發(fā)病率高且穩(wěn)定的RA 動物模型至關(guān)重要。國際上應(yīng)用較多的RA 動物模型主要為膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)和佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)。CIA 是以II 型膠原作為抗原進行免疫，誘發(fā)動物機體針對關(guān)節(jié)軟骨的主要化學成分II 型膠原進行自身免疫攻擊，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎，此模型最常用的易感動物為DBA/1J 小鼠［2］。由于DBA/1J 小鼠國內(nèi)不易獲得，因此我們選擇AIA 模型進行研究。AIA 模型最常用的易感動物為Lewis 大鼠，來源方便有保證，其發(fā)病原理為分子模擬理論。結(jié)核桿菌的一個蛋白分子與關(guān)節(jié)滑膜上的一個糖蛋白分子結(jié)構(gòu)相似，可以被同一株T 細胞克隆所識別，從而誘發(fā)針對關(guān)節(jié)的免疫反應(yīng)［3］。我們根據(jù)近幾年國際上出現(xiàn)的改良方法，對AIA 模型造模方法進行了改進，以制備發(fā)病率高且穩(wěn)定的RA 動物模型。

成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)增殖是RA 的主要病理特征，過度增殖的FLS分泌細胞因子、趨化因子、粘附分子和蛋白酶等，在關(guān)節(jié)破壞的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［4，5］，F(xiàn)LS 因而成為近年來RA 治療研究的新熱點。FLS 是炎性滑膜組織中數(shù)量最多的細胞類型，在炎性條件下FLS類似腫瘤細胞樣瘋狂增長促進滑膜組織異常增生是RA 炎癥最重要的病理表現(xiàn)。從滑膜組織中分離培養(yǎng)FLS 因而成為RA 信號機制及治療研究的理想的體外細胞模型。由于商業(yè)化FLS 價格昂貴，而且只能培養(yǎng)8～10 代，之后便失去增殖能力，因而我們嘗試從AIA 炎性關(guān)節(jié)滑膜中分離并培養(yǎng)FLS。為今后的RA 治療藥物評價及作用機制研究提供良好的體內(nèi)動物模型和體外細胞模型。

1 材料和方法

1.1 大鼠佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動物模型制備

無菌條件下充分研磨熱滅活結(jié)核桿菌H37Ra菌株(購于Difco 公司)，使其顏色由灰變白，并繼續(xù)研磨數(shù)分鐘，分3 次加入礦物油(購于Sigma 公司)，充分研磨使懸液成糊狀，制備成終濃度為5 mg/mL的混懸液;用玻璃注射器吸取混懸液，連接于三通管，并在三通管另一端插入另外一支注射器，來回推打兩只注射器使混懸液得到充分混勻從而完成佐劑制備。于Lewis 大鼠尾根部上方1～2 cm 的中心部位皮下注射上述佐劑制備液，每只220 μL。SPF 級Lewis 大鼠，6 周齡，體重(110 ±10)g，雌性，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012－0001】。動物飼養(yǎng)和實驗在軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心SPF 級屏障動物實驗設(shè)施進行【SYXK(軍)2007－004】，實驗經(jīng)軍事醫(yī)學科學院實驗動物倫理委員會審核批準，符合中國動物實驗的福利倫理準則，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 關(guān)節(jié)指數(shù)評分

按照0～4 分評分方法反映關(guān)節(jié)炎的嚴重程度:0 分，沒有紅腫(正常關(guān)節(jié));1 分，趾或指關(guān)節(jié)紅腫;2 分，踝或腕關(guān)節(jié)輕度腫脹;3 分，踝或腕關(guān)節(jié)中度紅腫，但還可以彎曲和行走;4 分，踝或腕關(guān)節(jié)重度紅腫，不能彎曲和行走即發(fā)生殘疾。對四肢都進行評分，每只動物最高關(guān)節(jié)指數(shù)為16 分。

1.3 關(guān)節(jié)病理學檢查

處死動物后，切取后肢踝關(guān)節(jié)，用4% 甲醛固定，進行脫鈣處理后縱向切開，進行石蠟包埋(每個關(guān)節(jié)可制作兩個臘塊)，制作冰凍組織切片，分別進行蘇木精＆ 伊紅(H＆E)染色和番紅O(safranin O)染色，顯微鏡下觀察組織學病理變化。H＆E 染色按照常規(guī)方法操作。番紅O 染色方法為:0.02%固綠水溶液染片3 min，1%冰醋酸洗滌去除殘留固綠;以0.1%番紅O 染色3min，脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡觀察。固綠和番紅O 染料均購于Sigma 公司。

1.4 成纖維樣滑膜細胞(FLS)的分離培養(yǎng)

造模免疫的第30 天左右，犧牲動物，分離嚴重腫脹的后踝關(guān)節(jié)，無菌條件下剝離關(guān)節(jié)滑膜組織，浸泡于盛有Ⅰ型膠原酶(2.5 mg/mL，購于Sigma 公司)的無血清DMEM 培養(yǎng)液中，剪碎成盡可能小的組織塊，移至培養(yǎng)瓶中消化培養(yǎng)過夜;次日將培養(yǎng)液用200 目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，棄雜質(zhì)，用離心管收集濾液，1500 r/ min 離心10 min，小心去除上清，加入DMEM 細胞培養(yǎng)液(含20% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素)懸浮細胞，按每毫升1 ×106個細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，次日棄去未貼壁細胞，貼壁細胞即為原代成纖維樣滑膜細胞。長滿瓶底后傳代培養(yǎng)。

1.5 流式分析

培養(yǎng)的第3 代FLS 經(jīng)0.25% 胰酶消化，離心，去上清，收集細胞分別與PE 標記的小鼠抗大鼠VCAM-1 抗體及同型對照小鼠IgG(陰性對照)在4℃避光條件下孵育30 min，洗滌細胞，流式細胞儀檢測滑膜細胞VCAM-1 表達情況。以上抗體均購于Biolegend 公司。

1.6 統(tǒng)計學分析

對關(guān)節(jié)指數(shù)、踝關(guān)節(jié)厚度和體重等指標使用的統(tǒng)計學分析方法為“具有一個重復(fù)測量的兩因素設(shè)計定量資料方差分析”，使用9.1.3 版本的SAS 專業(yè)軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 AIA 模型的臨床表現(xiàn)

用熱殺死分支結(jié)核桿菌與礦物油混合制備佐劑，尾根部皮內(nèi)單次免疫Lewis 大鼠進行動物造模，成功誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生:炎癥可發(fā)生在四肢，包括掌指關(guān)節(jié)、跖趾關(guān)節(jié)趾/指間關(guān)節(jié)、踝/腕關(guān)節(jié);嚴重的癥狀主要發(fā)生在后肢，涉及整個爪尤其是踝關(guān)節(jié)，如不給予有效治療，踝關(guān)節(jié)將在免疫后的第20 天左右變成殘疾，即不能彎曲和行走，而且這種損壞是不可逆的。見圖1(彩插11)。

圖1 大鼠佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)Note: A.Normal hind limb;B.Redness and swelling of the toe joints;C.Redness and swelling of the wrist joint;D.Mild redness and swelling of the ankle joint;E.Moderate redness and swelling of the ankle joint;F.Severe redness and swelling of the ankle joint;G.Severe redness and swelling of both hind limbs(R, right hind limb;L, left hind limb).Fig.1 The clinical signs of rats with adjuvant-induced arthritis

2.2 AIA 模型的臨床指標觀察和檢測

盡管大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴重癥狀主要出現(xiàn)在后肢，我們依然采用國際標準的評分方法4 分法(0～4分)對大鼠的四肢進行了評分(每只最大得分為16分)，這樣更能全面的評價全身的炎癥發(fā)展情況和嚴重程度。從免疫后第9 天開始觀察，每兩天檢測一次，直至佐劑造模免疫后的第25 天。動物發(fā)病率為100%，并且發(fā)病時間均在免疫后的第11 或12天，第15～19 天時發(fā)病達到高峰，在此之后，前肢包括指關(guān)節(jié)和腕關(guān)節(jié)的紅腫可有一定程度消退或者完全消退，但后爪尤其是踝關(guān)節(jié)的腫脹依舊維持，大部分會發(fā)生殘疾即不能彎曲和行走(見圖2A)。為了能更客觀的評價炎癥的嚴重程度，我們應(yīng)用電子游標卡尺對左右兩側(cè)踝關(guān)節(jié)的厚度進行了定量測量，將左右數(shù)值相加作為踝關(guān)節(jié)厚度指標數(shù)值。檢測時間為造模第1、4、7、11、14、17、21 和26 天。結(jié)果表明從第14 天開始，AIA 組的踝關(guān)節(jié)厚度明顯高于正常組(P＜0.05，見圖2B)，與關(guān)節(jié)指數(shù)和臨床表現(xiàn)相一致。此外，我們還通過監(jiān)測大鼠體重來反映動物的精神和生活狀況。AIA 組大鼠體重從第11 天開始明顯低于正常組，表明炎癥對食欲、活動等具有一定程度影響(圖2C)。對以上結(jié)果我們進行了多次驗證。通過以上實驗，我們建立了良好的關(guān)節(jié)炎動物模型，其發(fā)病率為100%且發(fā)病時間集中穩(wěn)定。

圖2 AIA 模型的臨床指標測量(* P＜0.05)Fig.2 Measurements of clinical indexes of the rat AIA models(* P＜0.05)

2.3 AIA 大鼠踝關(guān)節(jié)的病理學改變

分離大鼠后踝關(guān)節(jié)，脫鈣處理后，縱向切開，石蠟包埋，每個關(guān)節(jié)制作兩個臘塊，制作組織切片，H＆E 染色，顯微鏡下觀察，主要觀察滑膜增生和炎性細胞浸潤等組織學表現(xiàn)。正常關(guān)節(jié)滑膜平滑完整，關(guān)節(jié)腔清晰無雜質(zhì)，未見滑膜組織增生和炎性細胞浸潤;而AIA 關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)粗糙，明顯受到破壞，細胞增生明顯且排列不規(guī)則，血管翳大量生成，大量增生的滑膜細胞侵入關(guān)節(jié)腔使關(guān)節(jié)間隙變狹小，并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨，增生的滑膜組織中可見大量炎性細胞浸潤(圖3，彩插11)。除了對關(guān)節(jié)炎癥包括滑膜增生和炎性細胞浸潤等指標進行觀察外，觀察了關(guān)節(jié)軟骨的蛋白聚糖含量(蛋白聚糖是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，可被Safranin O 染成橘紅色)，用以反映關(guān)節(jié)軟骨的完整性或被破壞的程度［6］。結(jié)果表明，正常大鼠關(guān)節(jié)軟骨染色明亮清晰，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)光滑完整;而AIA 關(guān)節(jié)軟骨色彩暗淡，結(jié)構(gòu)明顯遭到破壞(圖4，彩插12)。以上結(jié)果表明，AIA 處理組大鼠踝關(guān)節(jié)發(fā)生了明顯的病理學改變，這些變化與RA的病理學特征相似，是一個良好的RA 實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

2.4 成纖維樣滑膜細胞的分離培養(yǎng)

成纖維樣滑膜細胞是滑膜組織中的主要細胞類型，在RA 發(fā)病機制及關(guān)節(jié)破壞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因而具有重要的研究意義。鑒于該細胞商業(yè)價格昂貴，我們利用膠原酶消化法，從患關(guān)節(jié)炎大鼠的滑膜組織中分離培養(yǎng)了成纖維樣滑膜細胞。原代細胞生長較緩慢，約一周時間擴展成片，細胞形態(tài)呈現(xiàn)梭型，并呈放射樣生長(圖5A);第二代細胞生長較原代細胞快，約5d 即鋪滿瓶底，細胞形態(tài)也比原代的均一，呈長梭形(圖5B);第三代細胞生長速度明顯加快，很快便會成片生長，約兩天即可長滿瓶底(圖5C)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白(GFP)的第三代FLS，可清晰觀察到細胞形態(tài)呈紡錘形，兩極細胞突細長，細胞核呈卵圓形(圖5D)。從第八代開始，F(xiàn)LS 生長明顯緩慢，第十代時基本喪失分裂增殖能力。圖5 見彩插12。

圖3 踝關(guān)節(jié)的H&E 染色組織學觀察Note: A.Normal ankle joint;B.Ankle joint of AIA.Fig.3 Histological appearance of the ankle joints.HE staining

圖4 番紅O 染色觀察關(guān)節(jié)軟骨完整性Note: A.Normal ankle joint;B.AIA ankle joint.Fig.4 Joint cartilage integrity of the ankle joints.Safranin O staining

圖5 大鼠AIA 成纖維樣滑膜細胞（FLS）的分離培養(yǎng)（標尺： 50 μm）Note: A.Primary FLS;B.FLS of passage 2;C.FLS of passage 3;D.Transfection with GFP of FLS of passage 3.Fig.5 Isolation and culture of fibroblast-like synoviocytes(FLS)from AIA rats(scale bar: 50 μm)

2.5 成纖維樣滑膜細胞的鑒定

成纖維樣滑膜細胞(FLS)表達血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)，后者是目前常用的鑒定FLS 的特異標記物［7］。應(yīng)用流式細胞術(shù)對本研究中培養(yǎng)的第3 代FLS 的VCAM-1 表達率進行檢測，結(jié)果顯示第3 代 AIA 大鼠 FLS 的 VCAM-1 表達率為90.18%，表明所培養(yǎng)的滑膜細胞主要為FLS，純度較高(圖6)。

3 討論

圖6 成纖維樣滑膜細胞VCAM-1 的表達Fig.6 Expression of VCAM-1 by the fibroblast-like synoviocytes

傳統(tǒng)的佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(AIA)又被稱為弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，通過皮下注射完全弗氏佐劑而誘導(dǎo)動物關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，該方法的常用動物是對關(guān)節(jié)炎易感的Lewis 大鼠［8］。AIA 模型已被廣泛應(yīng)用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)的藥物篩選及藥效機制的研究工作中。近年來出現(xiàn)了改良的AIA 誘導(dǎo)方法，我們對該方法進行了嘗試:采用熱滅活結(jié)核桿菌H37Ra 菌株與礦物油充分研磨混合，制成終濃度為5 mg/mL的溶液，一次性尾根部皮下注射0.2 mL，發(fā)現(xiàn)從免疫后的第11 天，炎癥開始出現(xiàn)在四肢，包括跖趾/掌指關(guān)節(jié)、趾/指間關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)和腕關(guān)節(jié)等;免疫后17～19 d 炎癥達到高峰，以踝關(guān)節(jié)重度腫脹為主，關(guān)節(jié)出現(xiàn)畸形并喪失運動功能;在關(guān)節(jié)炎癥發(fā)展過程中同時伴有毛色暗淡、易脫毛和體重減輕等表現(xiàn)。我們應(yīng)用這種方法已經(jīng)免疫近60 余只大鼠，發(fā)病率為100%，發(fā)病時間基本為免疫第11 天，極少數(shù)在免疫第12～14 天時發(fā)病(占5%)，僅有一只在觀察快結(jié)束時(第25 天)發(fā)病，這些都是存在的個體差異表現(xiàn)?？傮w上該方法操作簡便、重復(fù)性好，是一個良好的RA 造模方法，而且其病理表現(xiàn)也與RA 相似。在此之前我們曾應(yīng)用膠原誘導(dǎo)的方法對Lewis大鼠進行造模(II 型膠原加不完全弗氏佐劑，尾根部四點皮內(nèi)注射，第7 天加強免疫一次)，發(fā)病率不及60%，其中的原因我們也在進一步探討，但是我們認為應(yīng)用Lewis 大鼠使用佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的方法可能好于膠原誘導(dǎo)(膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大部分使用的動物為DBA/1J 小鼠)。

最近研究認為，滑膜增厚的主要原因是由于成纖維樣滑膜細胞(FLS)的過度增殖。通過阻止FLS的增生和活化，對控制RA 病情發(fā)展具有重要意義，F(xiàn)LS 也因而成為RA 治療的新型靶細胞［9，10］。從滑膜組織中分離獲得FLS 將為RA 研究提供良好的體外細胞模型。由于FLS 較難獲得，而且不能無限傳代(一般8～10 代以后增殖能力就明顯降低)，使得市售的FLS 價格昂貴，因而限制了其在研究中的應(yīng)用。我們從上述誘導(dǎo)的AIA 大鼠炎性關(guān)節(jié)中剝離滑膜組織，應(yīng)用酶消化法分離并培養(yǎng)FLS，并通過流式檢測進行了驗證。本研究分離的FLS 可以傳至10 代，之后便很難再擴大培養(yǎng)，表明失去了增殖能力，因此使用3～8 代細胞進行相應(yīng)研究較為合適，并可凍存3～6 代細胞作為備用細胞。為使分離的FLS 純度較高，建議在剝離滑膜時盡可能地去除附著的結(jié)締組織，并充分將滑膜組織剪碎。以上RA動物模型的建立及FLS 的分離和培養(yǎng)，為我們今后探討RA 可能的發(fā)病機制、研究和開發(fā)新的治療方案或藥物提供了良好的工具。

(本文圖1，3 見彩插11，圖4，5 見彩插12)

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