小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立及病理組織學(xué)比較

張忠，程富勝，賈寧，車清明，尹鳳琴，祝艷華

(1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅武威 733006;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種發(fā)病率較高的炎癥性腸病，且具潛在的癌變可能性［1］。在歐美國家相當(dāng)常見，國內(nèi)雖然未見明確的流行病學(xué)報(bào)道，但近幾年發(fā)病率有上升趨勢［2］。UC在馬，猴，豬等動(dòng)物中都有散發(fā)，因病因復(fù)雜，迄今尚無定論。動(dòng)物模型的建立對疾病，病因，病變發(fā)展規(guī)律及治療的手段以及新藥的開發(fā)與研究等有重要意義［3］。目前國內(nèi)外對UC 動(dòng)物模型已進(jìn)行研究，取得了較大進(jìn)展，就目前的國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道對UC 動(dòng)物模型的建立方法基本上有4 類:①化學(xué)藥誘導(dǎo);②基因型動(dòng)物模型;③細(xì)胞移植動(dòng)物模型;④自發(fā)性動(dòng)物模型。本文采用乙酸(acetic acid，AA)刺激法，葡聚糖硫酸鈉法(dextran sodium sulfate，DSS)，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori.Hp)［4］制造小鼠UC 動(dòng)物模型，以探討建立UC 動(dòng)物模型的有效方法，為UC 的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感染用細(xì)菌

采用M13 號菌株(由本室保存，1998 年由胃潰瘍病人組織培養(yǎng)分離所得)，經(jīng)系列實(shí)驗(yàn)檢測確認(rèn)為Hp 菌株。

1.1.2 動(dòng)物及分組

清潔級BALB/c 小鼠40 只，雌雄各半，8～10 周齡，體重為20～25 g，購自中牧實(shí)業(yè)股份蘭州生物藥廠【SCXK(甘)2011-0001】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范》GB14925-2001。無菌手術(shù)在中牧實(shí)業(yè)股份蘭州生物藥廠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(甘)2011-0001】，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《甘肅省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》規(guī)定，經(jīng)由中牧實(shí)業(yè)股份蘭州生物藥廠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審核批準(zhǔn)，符合中國動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理準(zhǔn)則，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。隨機(jī)分為4 組，每組10 只。分別為AA 組，DAA 組，Hp 組和對照組。

1.1.3 試劑

乙酸，由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，規(guī)格每瓶500 mL。使用前用生理鹽水溶液稀釋為8%水溶液。葡聚糖硫酸鈉，購自華美試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 制備Hp 菌懸液

將M13 菌株液培養(yǎng)24h 后收集細(xì)菌，離心濃縮后分廣度以測定懸液中細(xì)菌含量，將濃度調(diào)整為109cfu/mL。

1.2.2 乙酸刺激法

10 只BALB/c 小鼠，造模前禁食2～3 h，經(jīng)肛門注入0.5 g/L 肥皂水0.15 mL，約30 min 后用2 g/L 戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉，插入直徑3 mm 的聚乙烯纖維導(dǎo)管至小鼠直腸內(nèi)深度約為1～2 cm，注入8%乙酸溶液0.15 mL，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10～20 s 后，再注入生理鹽水1～2 mL 沖洗，以消除乙酸的作用，之后，常規(guī)飼養(yǎng)。10 d 后，將動(dòng)物處死，切取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織約1 cm，放入液氮內(nèi)凍存待測。

1.2.3 DSS 法

取BALB/c 小鼠10 只，自由飲用3.5%葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)水溶液，同時(shí)分別灌胃給予干預(yù)藥物(0.2 mL/10 g·Wt，1 次/日，連續(xù)7 d)，7 d 后再飲用不含DSS 的蒸餾水14 d。給藥后第1 天起觀察小鼠體重，大便質(zhì)地及潛血或便血特征，并進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評分。連續(xù)用藥21 d 后將動(dòng)物處死，切取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織約1 cm，放入液氮內(nèi)凍存待測。

1.2.4 Hp 感染法

取BALB/c 小鼠10 只，以每只0.4 mL 灌喂Hp菌懸液(含菌4 ×108cfu)，2 h 后恢復(fù)給飲食48h 后再重復(fù)灌喂一次，連續(xù)3 d 重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，共感染3次。連續(xù)用藥10 d 后將動(dòng)物處死，切取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織約1 cm，放入液氮內(nèi)凍存待測。

1.3 檢測項(xiàng)目

1.3.1 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評估［5，6］

每日觀察小鼠的體重，大便性狀和隱血情況，按表進(jìn)行評分。將體重下降，大便性狀和隱血情況的評分相加，得出每只小鼠的DAI 以評估疾病活動(dòng)情況。見表1、2。

1.3.2 病理組織學(xué)檢測

將小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織切成6μm 厚的冰凍切片，常規(guī)HE 染色，普通光鏡下觀察黏膜炎癥情況，包括黏膜的完整性，黏膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤，隱窩結(jié)構(gòu)的改變程度和炎癥范圍。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的DAI 結(jié)果

乙酸(AA)組小鼠1～2d 即表現(xiàn)為懶動(dòng)，大便稀薄伴血性分泌物，體重減輕。

葡聚糖硫酸鈉(DSS)組小鼠第4 天開始出現(xiàn)體重下降，且幅度較大，第3 天開始出現(xiàn)腹瀉，直腸出血，第5 天后10 只小鼠均腹瀉且直腸出血。

幽門螺桿菌(Hp)組感染小鼠后第7 天小鼠出現(xiàn)食欲不振，懶動(dòng)等癥狀，至第10 天未出現(xiàn)腹瀉等癥狀。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)的評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Scoring of disease activity index(DAI)of the mice

表2 實(shí)驗(yàn)各組小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)Tab.2 Scoring of the disease activity indexes(DAI)in different groups

2.2 病理組織學(xué)比較觀察結(jié)果

整段結(jié)腸HE 染色組織學(xué)變化:對照組結(jié)腸黏膜上皮組織完整，結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體完整(圖1)。乙酸(AA)組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞萎縮、壞死、脫落，成腸壁變薄，皺襞消失，黏膜下淋巴細(xì)胞增生并有淋巴濾泡形成，結(jié)構(gòu)模糊(圖2)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)組黏膜廣泛缺失，腺體多數(shù)不完整，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，呈典型炎癥改變(圖3)。幽門螺桿菌(Hp)組結(jié)腸段無明顯病變(圖4)(圖1～4 見彩插4)。

3 討論

張曉峰［7］研究發(fā)現(xiàn)乙酸誘導(dǎo)UC 動(dòng)物模型的作用機(jī)理與乙酸直接刺激使血管通透性增加，激肽激活，溶解纖維蛋白活性增加以及凝血機(jī)制障礙有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中乙酸誘導(dǎo)的UC 模型在實(shí)驗(yàn)后1～3 d 即出現(xiàn)明顯的癥狀和結(jié)腸黏膜的典型損傷。李林等［8］報(bào)道1970 年有人就開始用乙酸制作小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其結(jié)腸產(chǎn)生的炎癥以及細(xì)胞因子的變化類似于人類UC 的變化，之后便應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性UC 研究，該模型至今仍被廣泛使用。2010 年吳玉泓等［9］用免疫致敏結(jié)合局部乙酸刺激法復(fù)合建立了適合藥效觀察和評價(jià)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。乙酸誘導(dǎo)UC 模型制作方法簡單，成本低，短期內(nèi)可使小鼠出現(xiàn)UC 明顯的癥狀幾典型病理變化，是目前實(shí)驗(yàn)性UC 模型中應(yīng)用最廣泛的模型之一，適合于臨床研究UC 的發(fā)病機(jī)制以及新藥的研制開發(fā)。但由于乙酸直接刺激造成結(jié)腸黏膜和血管的損傷，與臨床致病因素有較大差異，且最初黏膜損傷的非特異性炎癥呈現(xiàn)急性過程，不能表現(xiàn)人類UC 所具有的慢性，復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，也是其不足之處;另外，乙酸刺激模型自愈性強(qiáng)，不適宜觀察療程較長的藥物療效［10］。

DSS 是一種硫酸多糖，市售DSS 的分子量從5000 到50 000 不等。1985 年，Ohxusa［11］最先用倉鼠建立了DSS 結(jié)腸炎模型，并發(fā)現(xiàn)其病變與人類UC 類似。其后，Okayasu 等和Cooper 等先后用BALB/c 小鼠、C57 小鼠、SW 小鼠建立了DSS 急性和慢性結(jié)腸炎模型［11，12］。本實(shí)驗(yàn)中讓BALB/c 小鼠自由飲用3.5% DSS 以誘發(fā)結(jié)腸炎，BALB/c 小鼠飲用3.5% DSS 溶液7 d 后，主要表現(xiàn)為腹瀉、血便、體重下降、懶動(dòng)等。而光鏡下組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為全結(jié)腸多灶性小潰瘍，隱窩破壞和繼發(fā)黏膜，黏膜下炎癥，少數(shù)病灶炎癥可侵及黏膜層，浸溶的炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，伴少量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，而且21 d 后癥狀仍然明顯，自愈較慢，符合人類UC 所具有的慢性、復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。這些結(jié)腸炎癥病變與Okayasu 和Cooper 等觀察到的病變相似。DSS 誘導(dǎo)BALB/C 小鼠發(fā)生潰瘍性結(jié)腸炎的模型制作簡便，經(jīng)濟(jì)，易于復(fù)制，是研究UC 發(fā)病機(jī)制和藥物療效較理想的工具，而且，該種造模方法耗時(shí)較以往多次循環(huán)使用DSS 誘發(fā)慢性結(jié)腸炎明顯縮短，值得推廣應(yīng)用。

現(xiàn)已證實(shí)，HP 是一種具有多種復(fù)雜致病因子的病原菌，在胃黏膜定植后，主要借助于致病因子發(fā)揮其致病作用，通過毒素的直接作用及誘導(dǎo)炎性反應(yīng)等間接作用而損害宿主組織.其中，尿素酶、空泡形成毒素(VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、脂多糖等都是主要的致病因子。Wang［13］研究表明，Hp 與慢性胃炎和消化性潰瘍的病因有密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)中Hp 能引起小鼠體重下降，腹瀉，直腸出血等癥狀，主要與這些致病因子有關(guān)，但病理組織學(xué)觀察表明Hp 不能引起典型結(jié)腸炎癥，尤其是人類常發(fā)生的慢性、復(fù)發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎。

4 結(jié)論

幽門螺桿菌(Hp)不適合建立UC 動(dòng)物模型，乙酸(AA)不適宜建立觀察療程較長的UC 動(dòng)物模型，而右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的BALB/C 小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型是研究UC 發(fā)病機(jī)制和藥物療效較理想的工具。

(本文圖1～4 見彩插4。)

圖1 對照組(H.E.染色)Fig.1 A control mouse(HE staining 400 ×)

圖2 AA 組(H.E.染色)Fig.2 A mouse of the AA group(HE staining 400)

圖3 DSS 組(H.E.染色)Fig.3 A mouse of the DSS group(HE staining)

圖4 Hp 組(H.E.染色)Fig.4 A mouse of the Hp group(HE staining)

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