人胃癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性

馬嵋，張燕，張玲，魏琴，段明軍，侯月梅

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率均占第一位的惡性腫瘤，研究人類胃癌生物學(xué)行為和抗腫瘤實(shí)驗(yàn)性治療則需要建立胃癌動(dòng)物模型。人胃癌裸鼠移植模型是研究人類腫瘤的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為研究胃癌生長(zhǎng)、分子調(diào)控、抗腫瘤藥物篩選提供基礎(chǔ)載體，提供癌細(xì)胞生物學(xué)特性和基因表達(dá)調(diào)控等研究方向的基礎(chǔ)資料［1］。

目前，建立胃癌模型的細(xì)胞株較多，并已經(jīng)有實(shí)際應(yīng)用到相關(guān)模型的研究［2-3］，但對(duì)小鼠模型建立的具體方法及成瘤情況的相關(guān)報(bào)道并不多。本文為通過(guò)培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)胃癌細(xì)胞株，采用皮下接種移植傳代方式，初步建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，觀察不同濃度的癌細(xì)胞懸液接種于裸鼠后，裸鼠模型的皮下移植瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)及生物學(xué)特性，為人類胃癌的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌細(xì)胞株

人胃癌BGC-823 細(xì)胞株(購(gòu)于中科院上海細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的SPF 級(jí)BALB/c(nu/nu)裸鼠【SCXK(新)2011－ 0001】，40 只，雌性，5～7 周齡，體重20～22 g。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心嚙齒屏障環(huán)境中進(jìn)行【SYXK(新)2011－0002】，飼養(yǎng)于獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中，溫度變化范圍20～26℃，照明控制設(shè)定為12 h 明暗交替，相對(duì)濕度變化范圍均為40%～70%［4］。整個(gè)過(guò)程符合中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理準(zhǔn)則，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.3 主要試劑及設(shè)備

RPMI1640 培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)、胎牛血清(Invitrogen 公司)、0.25% 胰酶(Neuronbc 公司)、DAB 顯色劑(KT011-上海滬峰生物科技有限公司)、Scepter-手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(上海密理博貿(mào)易有限公司)、SP 試劑盒(福州邁新公司)、PBS緩沖液、谷氨酰胺、臺(tái)盼藍(lán)染液(0.4%)。JEM-100cx 型電鏡。

1.2 方法

1.2.1 癌細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)

將凍存在－196℃液氮中的人胃癌BGC-823 細(xì)胞快速融化至37℃，放入離心機(jī)中3 000 r/min 離心3 min，向離心管內(nèi)加入10 mL 培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度以5 ×105個(gè)活細(xì)胞/mL 為宜。把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS 清洗(沖洗)，加入適量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。吸棄消化液加入培養(yǎng)液，棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液吸出分裝至2～3 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，放入37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2～4 h 后換液繼續(xù)培養(yǎng)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823 胃癌細(xì)胞以備使用［5］。

1.2.2 癌細(xì)胞接種

通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，確定細(xì)胞懸液濃度。將40 只裸鼠按接種細(xì)胞懸液濃度不同分為以下四組，組一細(xì)胞懸液濃度為每毫升含5 ×107個(gè)活細(xì)胞;組二細(xì)胞懸液濃度為每毫升含1 ×107個(gè)活細(xì)胞;組三細(xì)胞懸液濃度每毫升含1 ×106個(gè)活細(xì)胞;組四細(xì)胞懸液濃度每毫升含1 ×105個(gè)活細(xì)胞組。各組分別接種0.2 mL 懸液于裸鼠左腋窩皮下［6］。

1.2.3 裸鼠成瘤觀察

每日觀察裸鼠攝食、精神等情況，計(jì)算移植瘤成瘤率，成瘤后每2 d 由同一觀測(cè)者用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)及短徑(b)，取各組長(zhǎng)、短徑平均值，按公式V =ab2/2 計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤體積變化曲線。

1.2.4 腫瘤血管密度(microvessel density，MVD)的檢測(cè)

采用鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶連接法(S-P 法)檢測(cè)。將裸鼠移植瘤剝離，HE 染色切片。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行，過(guò)程為石蠟切片→常規(guī)脫蠟至水→抗原修復(fù)→3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→山羊血清封閉→滴加一抗、二抗及鏈霉素、S-P復(fù)合物→DAB 顯色→復(fù)染封片［7］。在低倍電鏡下掃視整個(gè)切片，找到瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰、高血管密度區(qū)(熱點(diǎn))，再用中倍鏡在熱點(diǎn)中計(jì)數(shù)CD34 抗體染色的陽(yáng)性血管數(shù)，取3 個(gè)熱點(diǎn)的平均陽(yáng)性血管數(shù)為微血管密度(MVD)，并用(x－±s)表示［8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有結(jié)果采用SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果用(x－±s)表示，組間比較用t 檢驗(yàn)及方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤觀察

共計(jì)接種40 只裸鼠，各組裸鼠攝食、精神情況正常，無(wú)死亡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組一出現(xiàn)明顯的移植瘤體平均在第3 天左右，實(shí)驗(yàn)組二平均為5 d 左右出現(xiàn)明顯移植瘤體，實(shí)驗(yàn)組三平均在第7 天出現(xiàn)明顯的移植瘤體，實(shí)驗(yàn)組四21 d 觀察期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的移植瘤體出現(xiàn)。裸鼠移植瘤呈局限膨脹性生長(zhǎng)，未觀察到明顯的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)。轉(zhuǎn)移瘤從皮下剝離時(shí)，見瘤體有完整包膜，表面光滑，邊界清楚，與皮膚稍有粘連。切開瘤體后有粘液滲出，瘤體切面呈魚肉狀。在接種后觀察的21 d 內(nèi)，除組四細(xì)胞懸液濃度每毫升105個(gè)活細(xì)胞的裸鼠未見明顯瘤體外，其余實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤成瘤率100%，各組瘤體體積生長(zhǎng)曲線見圖1。組一皮下移植瘤體出現(xiàn)最早，但是在第11 天以后瘤體生長(zhǎng)過(guò)快，到第19 天時(shí)體積為(1 636.61 ±113.87)mm3，第21 天時(shí)體積達(dá)到(2 342.40 ±265.33)mm3。組二瘤體生長(zhǎng)曲線較為平和，19 d 瘤體體積為(685.24 ±100.75)mm3，21 d為(1111.98 ±213.15)mm3。組三瘤體生長(zhǎng)變化相對(duì)組一組二較為緩慢，到第21 天時(shí)瘤體體積為(575.48 ±112.56)mm3。由表1 可見，各組之間瘤體生長(zhǎng)體積變化統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 裸鼠移植瘤體生長(zhǎng)曲線圖Fig.1 The growth curves of tumors in nude mice

表1 裸鼠移植瘤體積生長(zhǎng)(mm3)Tab.1 Changes of tumor volume in the nude mouse models(mm3)

2.2 腫瘤血管密度(MVD)的檢測(cè)

移植瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34 染色為黃棕色，記為陽(yáng)性細(xì)胞，各組MVD 的檢測(cè)結(jié)果見表2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較得出各組MVD 差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。各實(shí)驗(yàn)組平均每中倍視野中的微血管數(shù)為:(123.26 ±31.57)個(gè)/mm2。

表2 腫瘤血管密度(MVD)的檢測(cè)結(jié)果(個(gè)/mm2)Tab.2 The results of MVD measurement(number/mm2)

3 討論

人胃癌BGC-823 細(xì)胞株是目前較普遍使用的胃癌模型的細(xì)胞株，但在濃度使用時(shí)差異較大，因此模型的復(fù)制性較不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的人胃癌BGC-823 細(xì)胞株進(jìn)行對(duì)照，細(xì)胞懸液濃度過(guò)低，移植瘤體不易生成，接種濃度過(guò)高，引起腫瘤的生長(zhǎng)太快，影響進(jìn)一步的比較觀察或是藥物效果評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為1 ×107個(gè)活細(xì)胞/mL 或1 ×106活細(xì)胞/mL 濃度均可復(fù)制較穩(wěn)定的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束安樂(lè)死動(dòng)物解剖取材發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組帶瘤裸小鼠并未出現(xiàn)肝、肺、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分析原因可能為瘤體周圍被結(jié)締組織包裹，限制了瘤體浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，這與前人研究基本相似［9-10］。

由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情況下，不排斥來(lái)自異種動(dòng)物的組織移植，因此可作移植人類惡性腫瘤的接受體［8］。本實(shí)驗(yàn)采用BALB/c(nu/nu)裸鼠用作胃癌皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)成瘤率較高可能有以下幾方面原因:①鼠齡的選擇:新生裸鼠免疫功能尚未完全建立，故腫瘤生長(zhǎng)更容易更迅速，但是幼鼠耐受力較差，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。而隨著鼠齡的增長(zhǎng)，裸鼠體內(nèi)的免疫力增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中易發(fā)生排斥反應(yīng)，所以本次實(shí)驗(yàn)選擇的是5～7 周齡，體重20～22 g 的裸鼠，對(duì)癌細(xì)胞的耐受和排斥性都較為理想。②接種瘤細(xì)胞懸液濃度的選擇:裸鼠體重?zé)o明顯差異，接種細(xì)胞懸液計(jì)量定為每只0.2 mL，但是細(xì)胞懸液濃度過(guò)低，移植瘤體不易生成，接種濃度過(guò)高，引起腫瘤的生長(zhǎng)太快，影響進(jìn)一步的比較觀察或是藥物效果評(píng)價(jià)。③接種前后裸鼠的飼養(yǎng)管理:由于裸鼠先天免疫缺陷，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境有很嚴(yán)格的要求，本次實(shí)驗(yàn)裸鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中，溫濕度均達(dá)到裸鼠飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)要求，飼料飲水均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒，適量添加雞蛋和葵花籽，保證了裸鼠的正常生長(zhǎng)需要。④接種部位的選擇:皮下接種部位的選擇直接影響瘤體大小。在裸鼠背部靠近頭部皮下接種，便于操作且更易于觀察，但由于背部皮膚較緊會(huì)影響瘤體生長(zhǎng)。選擇腹部接種易于操作成瘤率高，但是腹部瘤體與墊料經(jīng)常摩擦極易導(dǎo)致外部損傷引起病變影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。選擇腋下接種，由于血管豐富且皮下游離空間大，既易使腫瘤成活又能使腫瘤長(zhǎng)大也不影響裸鼠本身的活動(dòng)。

腫瘤組織內(nèi)MVD 計(jì)數(shù)要點(diǎn):①可計(jì)數(shù)的微血管:血管腔及紅細(xì)胞不能計(jì)入微血管數(shù);與相鄰微血管或其他結(jié)締組織成分不相連的黃棕色內(nèi)皮細(xì)胞(簇)記為一個(gè);來(lái)源不清的血管內(nèi)皮細(xì)胞均計(jì)入微血管數(shù)。②不計(jì)數(shù)的微血管:在腫瘤硬化、瘤細(xì)胞稀少區(qū)及相近良性組織區(qū)的微血管;肌層較厚及管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞的血管。

本研究顯示腫瘤組織內(nèi)MVD 的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)組間差異無(wú)顯著性，表明皮下接種細(xì)胞懸液濃度與生長(zhǎng)的移植瘤MVD 值無(wú)明顯關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)胃癌細(xì)胞懸液制作裸鼠皮下移植瘤，細(xì)胞腫瘤體遺傳學(xué)特性保持了原人胃癌細(xì)胞株的特點(diǎn)，成功建立了人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶存在?？傊?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)皮下注射細(xì)胞懸液法構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型的方法，具備操作簡(jiǎn)單、成瘤時(shí)間短、成瘤率高、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，是較為實(shí)用的胃癌動(dòng)物模型，為后續(xù)體內(nèi)研究胃癌發(fā)病機(jī)制及基因治療等實(shí)驗(yàn)提供了良好的工具。

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