Ⅱ型糖尿病伴牙周炎病人牙齦組織中VEGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)的研究

郭留云，李亞靜，王芬英，楊志敏

(鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院暨河南省口腔醫(yī)院牙周科，河南鄭州450052)

牙周炎與糖尿病具有雙向相關(guān)性，與健康人相比，Ⅱ型糖尿病病人牙周炎發(fā)病率以及牙周破壞程度均顯著增高［1－2］。最近研究發(fā)現(xiàn):血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factors，VEGF)與牙周炎和糖尿病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。糖尿病是否可通過(guò)上調(diào)VEGF使牙齦組織微血管增多、血管通透性增加而促進(jìn)牙周炎的進(jìn)展，目前相關(guān)研究尚少。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法，比較Ⅱ型糖尿病伴牙周炎病人、全身健康的慢性牙周炎病人以及健康人牙齦組織中VEGF的表達(dá)水平及微血管密度(Microvessles Density，MVD)，探討其在糖尿病伴牙周炎時(shí)對(duì)牙周炎的進(jìn)展及組織破壞的作用。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

2010－01—2011－01在河南省口腔醫(yī)院牙周科就診的病人中選取Ⅱ型糖尿病1年以上并伴重度牙周炎的病人15例(DP組)，男8例，女7例，年齡41～67歲;按性別、年齡匹配選擇無(wú)糖尿病但患有重度慢性牙周炎的病人15例(CP組)，男9例，女6例，年齡40～65歲;同時(shí)選取無(wú)糖尿病且牙周健康者(齦溝深度≤3 mm，無(wú)牙周袋及附著喪失，X線片示無(wú)牙槽骨吸收)15例作為正常對(duì)照組(N組)，男8例，女7例，年齡20～32歲。所有研究對(duì)象均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn):①Ⅱ型糖尿病依據(jù)WHO(1999)確定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)≥7.0 mmol/L和(或)糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose test 2 h blood glucose，OGTT2hBG)≥11.1 mmol/L;②重度慢性牙周炎參照曹采方等標(biāo)準(zhǔn)［3］，全口牙中有附著喪失和骨吸收的位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)＞30%;炎癥較明顯或發(fā)生牙周膿腫;牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm;X線片示牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/2;牙多有松動(dòng);多根牙有根分叉病變;③口內(nèi)至少存留14個(gè)牙齒，其中有4個(gè)磨牙;④無(wú)其他全身性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn):①標(biāo)本采集前3個(gè)月內(nèi)做過(guò)牙周系統(tǒng)治療;②3個(gè)月內(nèi)使用抗生素或避孕藥;③妊娠期婦女及抽煙者。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

VEGF兔抗人多克隆抗體、CD34鼠抗人多克隆抗體(SANTA CRUZ，美國(guó));免疫組化SP試劑盒(武漢博士德)。

1.2.2 HE和免疫組化染色

實(shí)驗(yàn)組炎癥牙齦來(lái)源于具有拔牙指征而且治療計(jì)劃需要拔除的牙齒周?chē)例l或者翻瓣術(shù)切除的牙齦組織;健康牙齦來(lái)源于因冠延長(zhǎng)術(shù)而切除的牙齦組織，要求牙齦組織健康無(wú)炎癥，無(wú)探診出血。局麻下在預(yù)先準(zhǔn)備的部位切取牙齦組織約3 mm× 2 mm×2 mm，生理鹽水洗凈血污后置新鮮配置的中性福爾馬林液中固定后，常規(guī)制作5 μm石蠟切片。HE染色觀察組織形態(tài);按照SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，觀察VEGF表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定

光學(xué)顯微鏡觀察以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為VEGF陽(yáng)性，不著色為陰性，每張切片在高倍鏡下(× 400)隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的視野，通過(guò)與顯微鏡相連的設(shè)備進(jìn)行拍照，將切片圖像輸入計(jì)算機(jī)后，用圖像分析系統(tǒng)(Biosens Digital Image Analysis Systems)分析所選取圖像中VEGF染色陽(yáng)性反應(yīng)部位的光密度值，取其平均值以反映該標(biāo)本的表達(dá)強(qiáng)度。

MVD計(jì)數(shù)判定:以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn);MVD測(cè)定方法:首先在100倍光鏡下挑選被CD34著色的微血管密度最高區(qū)域，然后在200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野中的微血管數(shù)目，取其平均值作為MVD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

健康對(duì)照組牙齦由復(fù)層鱗狀上皮和固有層組成，復(fù)層鱗狀上皮明顯角化或不全角化，上皮釘突插入固有層中，固有層為致密的結(jié)締組織，膠原纖維交織成網(wǎng)狀，主要由紡錘狀成纖維細(xì)胞和小血管組成，幾乎不見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Ⅱ型糖尿病伴牙周炎組與慢性牙周炎組可見(jiàn)上皮及其下方結(jié)締組織大量炎癥細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞)浸潤(rùn)，膠原變性，成纖維細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管增生。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

VEGF陽(yáng)性染色為棕黃色，主要定位于細(xì)胞的胞漿，正常和炎癥牙齦組織都有VEGF的陽(yáng)性表達(dá)。在健康對(duì)照組牙齦組織中，VEGF陽(yáng)性主要定位于牙齦上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的低量表達(dá)(圖1)。而慢性牙周炎組(圖2)和Ⅱ型糖尿病伴牙周炎組(圖3)VEGF在牙齦上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞)均有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，各組牙齦組織均有陽(yáng)性表達(dá)，被CD34染色陽(yáng)性的小血管和微血管主要位于牙齦結(jié)締組織，棕黃色細(xì)胞呈點(diǎn)狀、線狀或管狀結(jié)構(gòu)分布。健康對(duì)照組(圖4)鏡下觀血管管腔較大，分支很少，形態(tài)成熟。慢性牙周炎組(圖5)和Ⅱ型糖尿病伴牙周炎組(圖6)鏡下可見(jiàn)大量新生血管，血管管腔大小不等，細(xì)小分支較多。

圖1 健康對(duì)照組VEGF低表達(dá)(免疫組化 ×400)

圖3 糖尿病伴牙周炎組VEGF高表達(dá)(免疫組化 ×400)

圖4 健康對(duì)照組MVD計(jì)數(shù)狀況(免疫組化 ×200)

圖5 慢性牙周炎組MVD狀況(免疫組化 ×200)

圖6 糖尿病伴牙周炎組MVD狀況(免疫組化 ×200)

2.3 圖像分析結(jié)果

2.3.1 VEGF在各組牙齦組織中表達(dá)水平比較

各組VEGF陽(yáng)性部位光密度值比較(表1)，Ⅱ型糖尿病伴牙周炎組平均VEGF表達(dá)水平最高，慢性牙周炎組次之，健康對(duì)照組最低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組牙齦組織中VEGF陽(yáng)性部位光密度值比較 (±s)

表1 各組牙齦組織中VEGF陽(yáng)性部位光密度值比較 (±s)

不同字母組間P＜0.05

組別 樣本量 平均光密度值N 15 95.660±1.051a CP 15 124.990±1.983b DP 15 142.774±1.225c

2.3.2 各組牙齦組織中的MVD計(jì)數(shù)

Ⅱ型糖尿病伴牙周炎組平均MVD計(jì)數(shù)最高，慢性牙周炎組次之，健康對(duì)照組最低(表2)，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組牙齦組織中MVD計(jì)數(shù)比較 (±s)

表2 各組牙齦組織中MVD計(jì)數(shù)比較 (±s)

不同字母組間P＜0.05

組別 樣本量 MVD 計(jì)數(shù)N 15 12.200±0.840a CP 15 26.867±1.107b DM 15 47.600±1.689c

3 討論

很多流行病學(xué)調(diào)查和醫(yī)學(xué)研究表明:牙周炎與糖尿病之間具有雙向相關(guān)性，互相增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病可加重牙周炎病人牙周組織的破壞程度，而牙周炎又可影響糖尿病的代謝控制，因此有學(xué)者將牙周炎列為糖尿病的第六并發(fā)癥［4］。VEGF是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能生長(zhǎng)因子，也稱(chēng)血管通透因子(VPF)，是微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵因子，在正常組織中表達(dá)較低，病理狀況如組織缺血缺氧、腫瘤、炎癥時(shí)VEGF表達(dá)上調(diào)。血管反應(yīng)在慢性炎癥進(jìn)展期起重要作用，主要包括血管數(shù)目增加和血管通透性增高。VEGF可通過(guò)增加血管通透性而促進(jìn)白細(xì)胞和血漿蛋白的滲出，引起局部炎性水腫，靜脈壓升高，繼發(fā)局部缺氧，加速炎癥進(jìn)展;同時(shí)VEGF還是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，VEGF可通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖、分化、遷移以及血管基底膜膠原蛋白的水解而形成新生血管即血管生成(angioenesis)，新生血管能夠運(yùn)送炎癥細(xì)胞、炎癥因子、粘附分子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)至病損區(qū)，參與炎癥反應(yīng)的持續(xù)與進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)牙周炎病人齦溝液VEGF水平遠(yuǎn)高于牙周健康者，而且與牙周炎臨床參數(shù)呈正相關(guān)［5］;糖尿病病人由于高血糖、缺氧等可導(dǎo)致VEGF水平升高。因此，糖尿病可能通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)增加牙周炎的易感性。

本研究結(jié)果顯示:在健康對(duì)照組牙齦組織中，VEGF陽(yáng)性主要定位于牙齦上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的低量表達(dá)，而慢性牙周炎組VEGF在牙齦上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞)均有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。且其表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05)，與Booth等［6］研究結(jié)果相似。慢性牙周炎組MVD計(jì)數(shù)亦明顯高于健康對(duì)照組MVD計(jì)數(shù)(P＜0.05)。這與Artese等［7］研究結(jié)果相一致。牙周炎病人牙齦組織中VEGF表達(dá)水平升高可能與牙周致病菌及其代謝物刺激牙周組織局部合成VEGF增加有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn):伴放線放線桿菌和牙齦卟啉單胞菌的膜泡以及外膜蛋白可上調(diào)體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞VEGF的表達(dá)［8］，同時(shí)IL－1和TNF－α也能誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞分泌更多的VEGF［9－10］;而且炎癥牙齦組織中大量被激活的炎癥細(xì)胞如漿細(xì)胞、單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞也合成和分泌VEGF。因此推測(cè)在牙周炎狀態(tài)下，牙齦組織中升高的VEGF通過(guò)介導(dǎo)血管生成，使微血管數(shù)目增多;通過(guò)促進(jìn)血管通透性，加重滲出進(jìn)而促進(jìn)牙周炎的進(jìn)展。

有研究發(fā)現(xiàn):高血糖、缺氧可刺激VEGFmRNA與蛋白的表達(dá)升高［11］，本結(jié)果顯示:Ⅱ型糖尿病伴牙周炎組平均VEGF表達(dá)水平和MVD計(jì)數(shù)均明顯高于單純慢性牙周炎組(P＜0.05)，表明牙齦組織中VEGF表達(dá)水平不僅與牙周組織的局部炎癥有關(guān)，而且與糖尿病本身相關(guān)。

糖尿病病人由于高血糖環(huán)境以及牙齦組織內(nèi)小血管基底膜增厚，血液黏稠度高使組織局部缺氧，導(dǎo)致牙周組織中VEGF表達(dá)升高;而且長(zhǎng)期高血糖可致血清中糖化末端產(chǎn)物(AGEs)的形成和聚集，AGEs可與血管壁和單核細(xì)胞表面的AGEs受體(AGER)結(jié)合，從而刺激牙周組織中的單核細(xì)胞合成更多的IL－1β、TNF－α和IL－6等一系列炎癥因子。同時(shí)，糖尿病病人中性粒細(xì)胞的趨化、遷移、吞噬和殺菌功能受損，牙周致病菌在逃避中性粒細(xì)胞的吞噬殺傷時(shí)又可刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，從而上調(diào)牙周組織中VEGF的表達(dá)。另外，糖尿病可導(dǎo)致膠原代謝障礙和中性粒細(xì)胞功能障礙，致使牙周感染難以消除，炎癥反應(yīng)加重，牙周病的菌血癥和內(nèi)毒素血癥使血循環(huán)中炎癥因子升高，刺激牙周局部VEGF的合成。VEGF水平的上升可以增強(qiáng)牙周炎的血管反應(yīng)，使炎癥組織中新生血管增多，血管通透性增加，以及通過(guò)介導(dǎo)骨吸收作用進(jìn)一步加重牙周炎癥的進(jìn)展，炎癥反應(yīng)加重進(jìn)而可以刺激炎癥細(xì)胞激活分泌更多炎癥因子入循環(huán)，加重胰島素抵抗，如此可形成惡性循環(huán)。

近年來(lái)，國(guó)外曾有相關(guān)方面文獻(xiàn)報(bào)道，Unlu等［12］、Guneri等［13］所選取的分別為健康人牙齦組織、重度慢性牙周炎病人與糖尿病伴牙周炎病人的牙周患病位點(diǎn)和健康位點(diǎn)的牙齦組織，研究發(fā)現(xiàn):糖尿病伴牙周炎病人與慢性牙周炎病人牙齦組織中VEGF表達(dá)均高于健康對(duì)照組，炎癥組均可見(jiàn)炎癥細(xì)胞中VEGF表達(dá)，本研究結(jié)果與之相一致。但與之不同的是:本研究中健康對(duì)照組也發(fā)現(xiàn)VEGF的陽(yáng)性表達(dá)，慢性牙周炎組遠(yuǎn)高于健康組，而上述兩位學(xué)者皆報(bào)道健康牙齦中未見(jiàn)VEGF表達(dá)，牙周炎組和健康組VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也許是個(gè)體間差異的結(jié)果，需加大樣本量進(jìn)一步研究。Sakallioglu等［14］用ELLSA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):血糖控制良好的Ⅱ型糖尿病伴牙周炎病人牙齦組織中VEGF含量高于慢性牙周炎病人牙齦組織VEGF的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Gonca等［15］報(bào)道:慢性牙周炎、Ⅱ型糖尿病伴慢性牙周炎病人牙齦組織中VEGFmRNA的表達(dá)沒(méi)有差異。綜上所述，目前VEGF與糖尿病伴牙周炎的關(guān)系尚未有定論。

本研究結(jié)果得出:Ⅱ型糖尿病伴牙周炎病人牙齦組織中VEGF強(qiáng)度和MVD計(jì)數(shù)增加，因此推測(cè)對(duì)VEGF與牙周炎糖尿病的關(guān)系的深入研究可能作為衡量糖尿病伴牙周炎的一個(gè)重要指標(biāo)。

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