牙周組織再生技術(shù)的研究進展

高麗娜 綜述;陳發(fā)明，金 巖 審校

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安710032)

牙周炎是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類口腔和全身健康的主要口腔疾病，因此牙周炎的預(yù)防和治療越來越引起學(xué)者們的重視。目前牙周炎臨床治療方法主要包括齦上潔治、齦下刮治、根面平整、牙周手術(shù)等，其目的是去除感染、阻止病變進程，但難以使已喪失的牙周組織獲得良好再生，臨床修復(fù)往往以長結(jié)合方式，即牙齦上皮組織沿牙根面生長，這種修復(fù)雖恢復(fù)了組織的連續(xù)性，但并未真正恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能。牙周組織再生的最終目的是實現(xiàn)牙槽骨、牙骨質(zhì)以及錨定在二者之間的牙周膜的再生與功能重建。本文就近年來牙周組織再生技術(shù)的進展作一綜述。

1 傳統(tǒng)的牙周組織再生

為了克服長結(jié)合上皮的發(fā)生和修復(fù)缺損的牙槽骨，再生醫(yī)學(xué)技術(shù)中骨移植術(shù)、引導(dǎo)組織再生術(shù)以及兩者的結(jié)合為牙周組織的再生帶來了希望。目前已廣泛的應(yīng)用于臨床牙周手術(shù)中。植骨術(shù)是指用骨和骨替代品植入牙周骨缺損部位，通過促進新骨的形成來修復(fù)骨缺損，恢復(fù)牙槽骨的解剖形態(tài)，以達到牙周組織再生和新附著形成的手術(shù)方法。該技術(shù)主要是利用植骨材料的骨發(fā)生、骨誘導(dǎo)、骨引導(dǎo)性發(fā)揮作用［1－2］。引導(dǎo)組織再生術(shù)是在牙周手術(shù)中利用膜性材料的物理屏障作用，阻止生長較快的結(jié)締組織、牙齦上皮細胞進入缺損區(qū)并保持一定的組織生存空間，引導(dǎo)牙周膜細胞優(yōu)先占領(lǐng)根面，從而為牙周組織的修復(fù)再生提供時間和空間［3－4］。繼引導(dǎo)組織再生術(shù)后，生長因子，釉基質(zhì)衍生物的使用雖一定程度上加速了牙周組織再生的進程［5－6］，但多年的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)的再生能力有限，再生組織僅僅局限在牙周缺損的底部，并且在很大程度上受缺損形式和剩余組織量的影響。

2 干細胞介導(dǎo)的組織再生

干細胞和再生醫(yī)學(xué)是近年來方興未艾的生物醫(yī)學(xué)新領(lǐng)域，其旨在通過干細胞移植、分化和組織再生，促進機體創(chuàng)傷修復(fù)、治療疾病。干細胞移植是否有效，能否實現(xiàn)向臨床轉(zhuǎn)化取決于移植細胞的來源和功能、移植到體內(nèi)的細胞能否準(zhǔn)確定位、移植細胞的存活數(shù)量以及與周圍組織的整合程度。不同移植方式移植的細胞其體內(nèi)發(fā)揮效果也不同。目前細胞移植方式主要有支架承載型和無支架型。其中支架承載型多見于組織工程，無支架型主要包括單細胞懸液注射，以及近些年來發(fā)展的細胞膜片技術(shù)。

2.1 單細胞懸液注射

傳統(tǒng)的干細胞移植主要通過注射骨髓細胞來治療一些致死性［7－10］或非致死性疾病如嚴重肝衰竭［11］、神經(jīng)系統(tǒng)疾病［12］、周圍缺血性疾病等。最近臨床上通過將骨髓細胞和骨骼肌細胞直接注射到缺血心肌來進行組織特異性功能修復(fù)，避免了整個器官的移植［13－14］。這種將單細胞懸液直接或間接注射到組織病損區(qū)的方法具有操作簡便、創(chuàng)傷小、適合治療各種疾病。但由于細胞懸液的流動性、注射后細胞容易丟失、不能準(zhǔn)確定位、不利于細胞與病損部位結(jié)合，導(dǎo)致發(fā)揮作用的細胞量很少;另外，細胞注射液不能提供一定的機械支持力、容易遷移進入毛細血管從而可能導(dǎo)致毛細血管栓塞，影響局部血供。最重要的是:這種方法促進牙周組織再生的能力有限，不能達到牙周組織的完全再生。Mcgire等［15］將自體牙齦成纖維細胞多次注射到預(yù)處理的牙齦乳頭處，以期恢復(fù)其高度，他們發(fā)現(xiàn)這種方法雖然安全，但只在組織愈合的前2個月有較明顯效果，且不能完全恢復(fù)至初始高度。

2.2 牙周組織工程技術(shù)

牙周組織工程主要包括三個因素:種子細胞、生長因子和生物支架。通過將體外培養(yǎng)的高濃度、功能相關(guān)的活細胞種植于具有良好生物相容性和生物降解性的細胞外基質(zhì)材料上，在生長因子的作用下，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，再將這種細胞和生物材料復(fù)合體植入牙周病損部位，以形成新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)牙周組織，達到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的［16－17］。魯紅等［18］報道:體外培養(yǎng)的動物自體牙周膜細胞(PDLCs)能在納米羥基磷灰石(nHAC)材料三維支架上牢固貼附并生長旺盛，將PDLCs－nHAC植入動物體內(nèi)，與對照組相比有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨質(zhì)生成，缺損處牙周組織幾乎完全再生 ，且未見上皮長入。由此可見:牙周組織工程在很大程度上促進了組織再生量，但也存在一些不足之處，如:①種子細胞來源和體內(nèi)分化問題，這些研究大多數(shù)是三維基質(zhì)上接種單一類型細胞后移植到組織缺損處，還沒有一個研究得到期望的組織重建，可能是由于細胞來源的選擇困難以及很難控制細胞在局部的分化;②生長因子的作用機制不完全了解以及緩、控釋問題;③支架材料可能引起的局部炎癥反應(yīng)影響再生微環(huán)境等問題。

真正的牙周組織再生是結(jié)構(gòu)和功能完整的再生，兩種硬組織(牙骨質(zhì)、牙槽骨)和軟組織(牙周膜)的再生是通過前體細胞和生長因子相互作用而發(fā)生的并有一定的時間差。因此要求移植細胞和生長因子在牙周組織再生中必須精確。換句話說，并不是僅僅通過移植單一類型的細胞到缺損處進行空間維護和在生物體內(nèi)進行組織分化，而需要通過細胞外基質(zhì)中各種生長因子與細胞相互作用來調(diào)節(jié)細胞的行為，使細胞到達相應(yīng)位點發(fā)揮相應(yīng)功能來促進組織再生。

2.3 細胞膜片技術(shù)

細胞膜片技術(shù)(cell sheet engineering)是近年來發(fā)展較快的一項組織工程學(xué)技術(shù)，它是采用非酶解的方式獲取種子細胞，以膜片中細胞自身分泌的細胞外基質(zhì)作為載體，從而使細胞之間的連接蛋白和細胞外基質(zhì)能夠被完整地保存，避免了使用酶消化法對細胞的生物學(xué)功能如離子通道、細胞因子感受器和細胞因子受體等造成損傷。同時細胞膜片上保留的粘附蛋白能更好地促進細胞粘附到組織上而不需要縫合。除此之外，細胞膜片還具有可塑性，不受缺損形態(tài)的影響;而且不需要支架材料，避免了支架材料降解成分對組織細胞的危害。目前該技術(shù)已大量應(yīng)用于皮膚、角膜、心臟和骨組織等再生醫(yī)學(xué)的研究，其中角膜緣上皮細胞和自體口腔黏膜細胞膜片已成功應(yīng)用于臨床［19］。

2.3.1 細胞膜片的制備方法

牙周膜細胞膜片技術(shù)的制備方法有酶溶解法、外科切取法和溫度敏感式培養(yǎng)法。Nagai N［20］(2004)將牙周膜細胞培養(yǎng)于鮭魚不全膠原上，采用膠原酶溶解法獲取了結(jié)構(gòu)較為完整的牙周膜細胞膜片。該方法對細胞的活性不存在負面影響，便于完整獲取大面積的單層細胞膜片。但是酶可降解細胞外基質(zhì)中的纖維結(jié)合素和整合素，可降低膜片的粘附力或致膜片的收縮。有報道稱:維生素C可以促進細胞外基質(zhì)的分泌［21］，通過含有維生素C的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)數(shù)周而獲得的細胞膜片，由于其具有一定的韌性，可以用細胞刮將其機械刮下。這樣不但不會破壞細胞之間的ECM和相關(guān)蛋白，同時可以避免由于胰酶消化而導(dǎo)致的細胞活性的丟失，但對于較大面積膜片的操作較為困難。溫度敏感式培養(yǎng)［22］法是利用聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有溫度響應(yīng)(即以32℃為界，在疏水性－親水性間可逆變化)的特性，將PNIPAAm以共價鍵形式固定在TCPs表面進行細胞培養(yǎng)，然后通過其溫度響應(yīng)性，使整體細胞群在保持細胞間連接狀態(tài)下以片狀形態(tài)得以脫附。與傳統(tǒng)酶解方法相比，溫度敏感式培養(yǎng)法獲得的細胞膜片可以最大限度地維持細胞間的正常連接，保持細胞外基質(zhì)的完整性，而且還具有完整的對胰酶－EDTA敏感的整合素。

外科剝離和溫度感應(yīng)式培養(yǎng)技術(shù)是目前較為常用的膜片制備技術(shù)，它可以最大限度地保存膜片內(nèi)的細胞外基質(zhì)和各種信號因子，并保存細胞－細胞外基質(zhì)間的三維連接。

2.3.2 細胞膜片技術(shù)在牙周組織再生中的應(yīng)用研究

目前細胞膜片技術(shù)已經(jīng)成為公認的方式應(yīng)用于角膜上皮、食管上皮、氣管上皮、肝、皮膚、心肌組織等組織的再生，最近細胞膜片工程又作為新手段開始應(yīng)用于牙周組織再生。Hasegawa等［23］用含維生素C的基礎(chǔ)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)人PDLCs 3周后形成細胞膜片，移植到免疫缺陷大鼠牙槽骨開裂模型的牙周組織缺損處，結(jié)果發(fā)現(xiàn):實驗組在牙周組織缺損區(qū)域形成類似正常牙周膜的結(jié)構(gòu)，包括有膠原纖維插入的無細胞牙骨質(zhì);而空白對照組則無類似的結(jié)構(gòu)形成，新生骨直接與根面接觸發(fā)生牙本質(zhì)－骨粘連或出現(xiàn)根面吸收。該實驗提示:牙周膜細胞膜片具有再生牙周組織的能力。

牙周組織是由軟、硬組織共同組成的一個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的功能系統(tǒng)，采用組織工程進行牙周組織重建時，移植的細胞必須同時具備修復(fù)結(jié)締組織和礦化組織的能力。為了提高PDLCs膜片的礦化潛能，F(xiàn)lores等［24］(2008)用含有成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成PDLSCs膜片，將其與牙本質(zhì)塊復(fù)合移植到免疫缺陷鼠背部皮下，形成了不成熟的牙骨質(zhì)和牙周膜結(jié)構(gòu);而僅通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的PDLSCs膜片(對照組)卻沒有觀察到類似結(jié)構(gòu)。隨后Flores［25］又將經(jīng)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)的人牙周膜細胞膜片應(yīng)用于無胸腺大鼠牙周穿通性缺損的修復(fù)，結(jié)果顯示礦化誘導(dǎo)組大多數(shù)樣本觀察到新生牙骨質(zhì)層和膠原纖維的附著;而對照組雖有密集的細胞外基質(zhì)和纖維形成，但牙骨質(zhì)再生率顯著低于實驗組。

與其他細胞移植方式相比，細胞膜片技術(shù)雖可避免酶消化過程對各種膜相關(guān)蛋白的水解，但細胞膜片的強度還不足以實際應(yīng)用。為加強牙周膜細胞膜片的強度，Akizuki等［26］將Beagle犬的自體牙周膜細胞在含有維生素C的基礎(chǔ)培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)2周獲得牙周膜細胞層片，再用強化透明質(zhì)酸膜作為載體回植到Beagle犬下頜雙側(cè)第一磨牙近中牙根頰面牙周缺損區(qū)，術(shù)后8周，實驗組3個術(shù)區(qū)觀察到有骨組織、牙周韌帶和牙骨質(zhì)形成，顯著高于僅用強化透明質(zhì)酸膜的對照組。Iwata［27］(2009)通過自體移植的方式在三壁骨缺損的牙根表面植入聚乙醇酸(PGA)支撐的三層牙周膜干細胞膜片，并用多孔β－磷酸三鈣充填骨缺損區(qū)，結(jié)果顯示:細胞膜片移植組再生出了新骨、牙骨質(zhì)以及連接二者排列整齊的膠原纖維，而沒有進行細胞膜片移植的對照組只觀察到有限的骨再生。

對于復(fù)雜組織再生，關(guān)鍵是創(chuàng)造一個近似天然的微環(huán)境，以控制細胞的增殖、遷移和分化。楊振華［28］(2009)模擬牙根－牙周發(fā)育的微環(huán)境，利用根端牙胚細胞條件培養(yǎng)液APTG－CM成功誘導(dǎo)形成PDLSCs細胞膜片，并利用膜片體外容易聚合成團的特性建立高密度細胞聚合體的三維立體培養(yǎng)體系;最后對具備一定強度和厚度的不同類型細胞聚合體進行體外修整、塑形和疊加后分別復(fù)合到陶瓷牛骨(CBB)和牙本質(zhì)片上移植到裸鼠皮下，結(jié)果顯示:移植6周形成了類牙周膜樣結(jié)構(gòu)。牙囊是在牙周組織發(fā)育早期通過上皮細胞層從正在發(fā)育的牙本質(zhì)中分離出來的，在牙發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。近年來，大量的體內(nèi)、體外研究證實:牙囊來源的細胞具有分化為牙周組織形成細胞(牙周成纖維細胞、成牙骨質(zhì)細胞和成骨細胞)的能力［29］。Handa等［30］將分離培養(yǎng)的牛牙囊細胞與羥基磷灰石復(fù)合，植入裸鼠體內(nèi)，4周即發(fā)現(xiàn)在羥基磷灰石表面有牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。Bai Yudi等［31］用上皮根鞘細胞(HERS)與牙囊細胞(DFC)共同培養(yǎng)1周后，I型膠原(col－1)、ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)、骨涎蛋白(BSP)等在mRNA水平均明顯提高;培養(yǎng)3周后，ALP、OCN、BSP、OPG表達陽性的DFCs細胞數(shù)量增多，DFCs也產(chǎn)生了更多的鈣化結(jié)節(jié)。作者又將HERS誘導(dǎo)3周后的DFC形成細胞膜片并移植到雄性大鼠網(wǎng)膜下，5周后發(fā)現(xiàn)有牙骨質(zhì)樣組織和牙周韌帶樣組織形成;而未經(jīng)HERS誘導(dǎo)的DFC膜片(對照組)僅產(chǎn)生了纖維組織。該實驗表明:經(jīng)HERS誘導(dǎo)后DFC細胞膜片可通過上皮－間充質(zhì)相互作用而產(chǎn)生牙周組織。

目前通過細胞膜片技術(shù)構(gòu)建組織主要有三種方式:一是單層細胞膜片直接移植到宿主體內(nèi)，如皮膚［32］、角膜上皮［33］、膀胱尿路上皮［34］、牙周韌帶組織［35］等;二是應(yīng)用同型細胞膜片多層復(fù)合來重建組織三維結(jié)構(gòu)，如心肌組織［36］、平滑肌組織［37－38］;三是通過不同類型細胞膜片的多層復(fù)合來構(gòu)建更加復(fù)雜的層狀組織結(jié)構(gòu)，如肝小葉［16］、腎小球。對于牙周組織，目前已證明基于單細胞類型的再生能力有限，多種細胞復(fù)合的細胞膜片可獲得滿意的結(jié)果。謝函等［39］將利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的人髂骨骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)和人牙周膜干細胞(PDLSCs)的混合膜片形成細胞團塊后與煅燒陶瓷牛骨復(fù)合移植到裸鼠皮下，結(jié)果顯示:再生出了帶有血管化的牙骨質(zhì)－牙周膜樣組織。該結(jié)果提示，混合的細胞膜片(團塊)能模擬牙周再生的微環(huán)境，從而達到生理學(xué)意義上的牙骨質(zhì)－牙周膜樣組織的再生。

3 牙周組織再生的發(fā)展和展望

3.1 干細胞的異體應(yīng)用

牙周膜干細胞被認為是牙周組織再生的最佳種子細胞來源，但牙周病的病人大多數(shù)是中老年人，牙周膜干細胞十分有限，且細胞體外培養(yǎng)時間很長，極大影響了牙周再生技術(shù)的開展。如果干細胞能異體應(yīng)用，通過建立細胞庫就可以擴大牙周再生種子細胞的來源，極大推進牙周組織再生的發(fā)展，加快牙周組織再生技術(shù)向臨床的轉(zhuǎn)化。要解決牙周膜干細胞的異體應(yīng)用，首先要研究牙周膜干細胞的免疫學(xué)特性，最近有學(xué)者［40］建立了一個新的方式，即將同種異體牙周膜干細胞膜片用于小型豬牙周炎模型中，結(jié)果顯示，移植12周后，自體牙周膜干細胞膜片組和同種異體牙周膜干細胞膜片組均表現(xiàn)出明顯的牙周組織再生，并且同種異體細胞移植在動物體內(nèi)并沒有發(fā)生免疫反應(yīng)。該研究證明了牙周膜干細胞具有低免疫原性。

3.2 提高細胞膜片的生物學(xué)性能和可操作性

細胞膜片是由細胞與自身分泌的細胞外基質(zhì)組成，移植到體內(nèi)后易于適應(yīng)環(huán)境，能較長時間保持細胞活性，且細胞的生長方式類似于組織塊法，細胞沿邊緣爬出。因此將細胞膜片適時引入到牙周組織工程將是今后牙周組織再生、重建可供選擇的方案之一。但這樣的結(jié)構(gòu)也決定了細胞膜片容易攣縮的特征，尤其是具有較強收縮能力的纖維細胞膜片在無外源性載體的支持下會因細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和細胞骨架的收縮而出現(xiàn)攣縮，但外源性載體的應(yīng)用可能會干擾組織的代謝和改建，且過度刺激細胞外基質(zhì)的分泌而對膜片的結(jié)構(gòu)和功能造成不利的影響，因此應(yīng)當(dāng)深入探討細胞和細胞外基質(zhì)的生物學(xué)機制以及優(yōu)化膜片制備的方式，充分保證有效的膜片強度并避免種子細胞的不利分化。另外，還應(yīng)綜合牙周再生的影響因素，系統(tǒng)地掌握不同的牙周缺損修復(fù)和組織再生對移植細胞的量效關(guān)系、移植時間以及移植途徑的需求，并通過建立先進的高解析度、非侵入式成像技術(shù)實時地評估組織再生的生理和功能療效。

3.3 微環(huán)境的調(diào)控

所謂的“微環(huán)境”，就是由細胞、生長因子和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)共同構(gòu)成的動態(tài)環(huán)境，它是細胞在體內(nèi)賴以生存的局部條件，控制著細胞的增殖、分化。為了能更好的保障移植細胞的量和細胞的活性，應(yīng)當(dāng)通過調(diào)控局部微環(huán)境，使移植膜片內(nèi)的細胞能在植床內(nèi)盡早而有效的附著、生長和轉(zhuǎn)化;通過物理、化學(xué)、生物刺激和調(diào)節(jié)膜片與受體組織相融合，盡早發(fā)揮功能，促進牙周組織再生。另一方面，目前對于牙周膜干細胞膜片在牙周再生中的研究多采用急性牙周缺損模型來評價，因干擾因素較少，能夠較為充分地證實牙周膜干細胞和細胞膜片的再生機制，但急性牙周缺損模型不能代表復(fù)雜的慢性牙周炎狀況，慢性牙周炎癥對牙周組織的影響是全方面的，包括牙周膜細胞、牙周韌帶、牙根面、牙周的生物力學(xué)性能等，因此應(yīng)當(dāng)進一步探討種子細胞與牙周微環(huán)境的相互作用，有針對性地改善各種不利的微環(huán)境因素對種子細胞的影響以促進真正意義上的功能性牙周組織重建。

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