α-synuclein致病機(jī)制和轉(zhuǎn)基因帕金森疾病模型研究進(jìn)展

張 麗，張連峰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

帕金森?。≒arkinson＇s disease，PD）是最常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一，其主要癥狀是運(yùn)動(dòng)功能的改變，如運(yùn)動(dòng)過(guò)緩、靜止震顫、步態(tài)畸形和姿勢(shì)不穩(wěn)等病變，最后導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力喪失。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著年齡增長(zhǎng)PD患病率逐漸增高，55歲以上的人群中，帕金森病的患病率超過(guò)1％，65歲以上約為2％［1］。

PD按遺傳發(fā)病形成可分為家族性與散發(fā)性?xún)煞N，家族性PD約占PD總數(shù)的10％～15％左右，具有明顯家族遺傳傾向（顯性或隱性），而散發(fā)性PD則占PD的絕大多數(shù)，無(wú)明顯遺傳傾向，但表現(xiàn)為某種遺傳易感性。α-synuclein是一種位于突觸前末梢的蛋白，該基因的兩種錯(cuò)義突變與家族性帕金森病密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein存在于許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的突觸末梢或細(xì)胞漿包涵體中，揭示該基因參與了神經(jīng)元的變性過(guò)程。

1 α-synuclein的表達(dá)與帕金森病

α-synuclein是一種分子量為14×103的小分子酸性可溶性蛋白。α-synuclein主要分布于神經(jīng)元突觸前末梢，尤其在腦內(nèi)新皮層、海馬、嗅球、紋狀體、背側(cè)丘腦、下丘腦、黑質(zhì)及小腦等部位的神經(jīng)元胞液中含量更加豐富［2］。PD病理特征是黑質(zhì)紋狀體多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元死亡，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)類(lèi)蛋白質(zhì)物質(zhì)減少以及特征性Lewy小體（lewy body，LB）。LB內(nèi)多種蛋白質(zhì)富集，包括α-synuclein、parkin、泛素等，其中，α-synuclein蛋白是其主要成分。作為L(zhǎng)B的重要組成部分，α-synuclein既見(jiàn)于散發(fā)的帕金森病患者，又見(jiàn)于有α-synuclein基因突變的帕金森病患者［3］。在大小鼠中，過(guò)度表達(dá)的野生型或突變型α-synuclein均能引起人類(lèi)帕金森病的部分關(guān)鍵表型和病理特征［4］。

2 α-synuclein神經(jīng)元毒性機(jī)制

PD主要源于中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元退行性變導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。α-synuclein的異常表達(dá)、聚集與神經(jīng)元變性密切相關(guān)。根據(jù)目前的研究進(jìn)展，可以將α-synuclein的神經(jīng)元毒性機(jī)制概括為如下4個(gè)方面。

（1）α-synuclein寡聚體和路易小體

在α-synuclein蛋白纖維化的過(guò)程中，存在αsynuclein寡聚體、寡聚體中間構(gòu)象——初原纖維（protofibrils）和最終的淀粉樣纖維包涵體（fibrillar inclusions）等不同聚集狀態(tài)［5-6］。首先，自然狀態(tài)下，α-synuclein呈無(wú)序的未折疊結(jié)構(gòu)的單體，但在高濃度時(shí)，它可轉(zhuǎn)變成α-synuclein寡聚體的中間構(gòu)象——初原纖維（protofibrils），與單體不同，這類(lèi)寡聚體富含B片層結(jié)構(gòu)，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類(lèi)寡聚體的形成過(guò)程中，這類(lèi)寡聚體先呈包含20～30個(gè)α-synuclein分子的圓柱狀結(jié)構(gòu)，隨后彼此聚合形成鏈條狀，最終轉(zhuǎn)化可溶性纖維多聚體。最后，借助于微管轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞有時(shí)能將這些小球狀的聚集物形成更大的包涵體，其中包含了纖維狀的a-synuclein及其他幾種蛋白質(zhì)。其中寡聚體毒性機(jī)制可能是通過(guò)整合于細(xì)胞膜引起胞膜的瞬時(shí)通透性增加及膜內(nèi)包含物的外滲［7-8］，初原纖維多聚體的出現(xiàn)則與破碎的高爾基器相關(guān)，是細(xì)胞變性的早期特征［9-10］，而包涵體（如路易小體）的形成可能是細(xì)胞自我保護(hù)的一種方式。

（2）線粒體功能障礙

線粒體功能障礙（主要是呼吸鏈功能異常）導(dǎo)致ATP合成衰竭也可出現(xiàn)帕金森病的臨床表現(xiàn)，使用相應(yīng)的藥物可使早期帕金森病患者的癥狀緩解。因此，線粒體功能障礙是PD研究中解釋神經(jīng)元損傷一個(gè)重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，α-synuclein基因過(guò)度高表達(dá)促進(jìn)GT1-7細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)改變，如線粒體腫脹、嵴空泡化［11］，在PC12細(xì)胞中引起線粒體去極化和誘發(fā)線粒體依賴(lài)的細(xì)胞死亡［12］，而且，表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞對(duì)于蛋白復(fù)合體I抑制劑魚(yú)藤酮更加敏感［13］。現(xiàn)已證實(shí)，α-synuclein可與線粒體呼吸系統(tǒng)的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素C氧化酶（COX）特異結(jié)合［14］。但是胞漿里的α-synuclein如何接觸、作用于線粒體內(nèi)膜的機(jī)制尚有待闡明。

（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體應(yīng)激

α-synuclein過(guò)表達(dá)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體囊泡運(yùn)輸障礙，進(jìn)而干擾細(xì)胞或者神經(jīng)元的正常功能［15］。在瞬時(shí)高表達(dá)α-synuclein的COS7細(xì)胞中觀察到高爾基體碎片［9］，這可能是αsynuclein異常積聚導(dǎo)致的結(jié)果。PC12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)α-synuclein，導(dǎo)致GRP 78和磷酸化的起始因子2α（eIF-2α）等兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal能夠一定程度上防止細(xì)胞死亡［16］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生在α-synuclein誘導(dǎo)表達(dá)后的4～8 h之后和細(xì)胞死亡之前。在α-synuclein過(guò)表達(dá)果蠅模型上，通過(guò)增加囊泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ab1的表達(dá)水平，能夠一定程度上減少α-synuclein誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元丟失［15］。值得警惕的是，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體應(yīng)激并不能完全逆轉(zhuǎn)多巴胺神經(jīng)元丟失，這表明在更復(fù)雜的系統(tǒng)中可能存在多種機(jī)制。然而，這些因素都還不能精確的解釋?duì)?synuclein如何影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的，也不能真正解釋DA神經(jīng)元群在PD中的選擇性損傷。

（4）氧化應(yīng)激

多巴胺能神經(jīng)元損傷是PD的主要病理特征，異常的a-synuclein聚集會(huì)破壞多巴胺的自身平衡，并增加黑質(zhì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激。多巴胺在多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)合成后立即被轉(zhuǎn)運(yùn)到單胺能囊泡中儲(chǔ)存，如果未被儲(chǔ)存，多巴胺能夠自氧化生成有毒性的多巴胺醌類(lèi)物質(zhì)，伴隨超氧化基和過(guò)氧化氫產(chǎn)生［17-18］。在多巴胺能神經(jīng)元中，變異a-synuclein導(dǎo)致囊泡數(shù)量減少，胞質(zhì)內(nèi)多巴胺濃度升高，使多巴胺依賴(lài)的氧化應(yīng)激增強(qiáng)。在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)野生型和突變型的a-synuclein都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，在多巴胺存在下，細(xì)胞存活數(shù)量大大減少，尤其是表達(dá)突變型的細(xì)胞［19］。因此，asynuclein聚集和多巴胺引起的氧化應(yīng)激可能是PD發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

4 α-synuclein帕金森動(dòng)物模型

為了闡明α-synuclein在PD中的可能作用機(jī)制，人們開(kāi)始嘗試建立各種動(dòng)物模型包括轉(zhuǎn)基因模型和病毒載體注射等其它模型。這些轉(zhuǎn)基因模型不同程度模擬了PD患者的病理表型，如αsynuclein蛋白的聚集和病理性沉積，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力喪失等，表一對(duì)不同啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的α-synuclein轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的表型進(jìn)行了比較。

表1 α-synuclein轉(zhuǎn)基因大鼠、小鼠模型的關(guān)鍵表型比較Tab.1 Comparison of key phenotypes ofα-synuclein transgenic mice and ratmodels

（1）PDGF-βαSNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Masliah等［4］制作和分析了人類(lèi)野生型αsynuclein轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠可檢測(cè)到胞漿及核內(nèi)的有電子致密包涵體，DA能神經(jīng)元減少、紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）活性減低及運(yùn)動(dòng)行為障礙等。與人類(lèi)PD不同的是，黑質(zhì)內(nèi)DA能神經(jīng)元無(wú)變性缺失。

（2）PDGF-αSNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠模型

高寧等［20］建立了A53T突變型α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠，免疫組化顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬、新皮層、紋狀體區(qū)出現(xiàn)人α-synuclein陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)能力障礙。

（3）PrP-αSNCAA30P轉(zhuǎn)基因小鼠模型

αSNCAA30P轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)能力障礙，如僵直、步態(tài)畸形和靜止震顫等。病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性神經(jīng)膠質(zhì)增生，未發(fā)現(xiàn)LB樣α-synuclein包涵體，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元系統(tǒng)無(wú)退行變性［21］。

（3）Thy1-αSNCAA53T和Thy1-αSNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Putten等［22］制作了α-synuclein野生型和A53T突變型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)系統(tǒng)均出現(xiàn)了與PD病人相似的α-synuclein病理學(xué)改變。

（4）Thy1-αSNCAA30P和Thy1-αSNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Kahle等［23］也通過(guò)建立轉(zhuǎn)基因鼠研究野生型和A30P突變型α-synuclein的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)兩種類(lèi)型的α-synuclein在兩種轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)元和軸突中都有異常聚集。

（5）α-Synuclein細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)基因小鼠（α-synuclein BAC）

Yamakado H等［24］建立人α-synuclein BAC轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出焦慮樣行為（可能反映PD早期的非運(yùn)動(dòng)癥狀）減少，下降的SERT表達(dá)水平可能提示其內(nèi)在分子機(jī)制。因此，α-synuclein BAC轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為評(píng)價(jià)α-synuclein劑量效應(yīng)的工具，具有重要研究?jī)r(jià)值。

（6）四環(huán)素誘導(dǎo)型SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠（tetOSNCAA53T）

Lin X等［25］成功建立了tetO-SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠。與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)障礙和中腦多巴胺能（mDA）神經(jīng)元變性，模擬了PD關(guān)鍵的運(yùn)動(dòng)表型和病理表型。而且，mDA神經(jīng)元也有明顯的亞細(xì)胞改變，如多巴胺釋放減少，高爾基體碎片，自噬體溶酶體系統(tǒng)損傷。此模型適用于PD的發(fā)病機(jī)制研究和α-synuclein蛋白積聚引發(fā)的神經(jīng)損傷。

（7）α-synuclein轉(zhuǎn)基因大鼠帕金森模型（Thy-A30P-A53T）

F.Lelan等［26］建立了Thy-A30P-A53T轉(zhuǎn)基因SD大鼠，轉(zhuǎn)基因大鼠雖然不存在運(yùn)動(dòng)障礙，但呈現(xiàn)出嗅覺(jué)障礙的PD早期非運(yùn)動(dòng)表型。人α-synuclein蛋白共定位于TH陽(yáng)性的嗅球（OB）神經(jīng)元上，而前腦腦室下區(qū)SVZ區(qū)則不表達(dá)。Thy-A30P-A53T轉(zhuǎn)基因大鼠可以作為研究人突變的α-synuclein對(duì)于嗅覺(jué)障礙的發(fā)展機(jī)制的有用工具。

（8）重組腺伴隨病毒介導(dǎo)α-synuclein過(guò)表達(dá)大鼠帕金森模型（rAAV-CBA-α-synuclein）

大鼠黒質(zhì)紋狀體注射rAAV-CBA-α-synuclein載體，α-synuclein野生型和突變型手術(shù)大鼠均表現(xiàn)出30～80％黒質(zhì)多巴胺神經(jīng)元丟失，紋狀體內(nèi)多巴胺水平下降40～50％。多巴胺神經(jīng)元丟失50～60％以上的大鼠還表現(xiàn)出嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙［27］。因此，rAAV-CBA-α-synuclein大鼠可以作為一種PD模型，它成功復(fù)制了人PD的主要病理特征、神經(jīng)生化特征和行為學(xué)特征。

綜上所述，大量研究工作揭示α-synuclein與神經(jīng)元變性相關(guān)。首先，α-synuclein蛋白聚集，形成具有疏水性的寡聚體，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。其次事件還包括ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等。最后，以上事件激發(fā)的細(xì)胞死亡。這些結(jié)論都依賴(lài)于α-synuclein相關(guān)動(dòng)物模型的發(fā)展［28-29］。這些動(dòng)物模型驚人地重現(xiàn)了PD疾病的早期特征。因此，應(yīng)合理地將其應(yīng)用到PD發(fā)病機(jī)制研究及其藥物治療研究等領(lǐng)域，為PD的研究提供重要手段。

［1］Zhang ZX，Roman GC，Hong Z，et al.Parkinson’s disease in China：prevalence in Beijing，Xian，and Shanghai［J］.The Lancet，2005，365（9459）：595-597.

［2］Recchia A，Debtto P，Negro A，et al.Alpha-synuclein and Parkinson’s disease［J］.The FASEB Journal，2004；18（6）：617-626.

［3］Spillantini MG，SchmidtML，Lee VM，et al.alpha-synuclein in Lewy bodies［J］.Nature，1997，388（6645）：839-840.

［4］Masliah E，Rockenstein E，Veinbergs I，et al.Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice：implications for neurodegenerative disorders［J］.Science，2000，287（5456）：1265-1289.

［5］Caughey，B.，Lansbury，P.T.Protofibrils，pores，fibrils，and neurodegeneration：separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders［J］.Annu.Rev.Neurosci，2003，26：267-298.

［6］W right，J.A.，Wang，X.，Brown，D.R.Unique copperinduced oligomers mediate alpha-synuclein toxicity［J］.FASEB J.，2009，23（8）：2384-2393.

［7］Zakharov SD，Hulleman JD，Dutseva EA，et al.Helical alpha synuclein forms highly conductive ion channels［J］.Biochem istry，2007，46：14369-14379.

［8］Waxman EA，Giasson BI.Molecular Mechanisms ofα-Synuclein Neurodegeneration［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1792（7）：616-624.

［9］Gosavi N，Lee HJ，Lee JS，et al.Golgi fragmentation occurs in the cells with prefibrillar alphasynuclein aggregates and precedes the formation of fibrillar inclusion［J］.J Biol Chem，2002，277：48984-48992.

［10］Fan J，Hu Z，Zeng L，et al.Golgi apparatus and neurodegenerative diseases［J］.Int J Dev Neurosci，2008，26 （6）：523-34.

［11］Hsu LJ，Sagara Y，Arroyo A，et al.alpha-synuclein promotes mitochondrial deficit and oxidative stress［J］.Am J Pathol，2000，157：401-410.

［12］Tanaka Y，Engelender S，Igarashi S，et al.Inducible expression of mutant alpha-synuclein decreases proteasome activity and increases sensitivity to mitochondria-dependent apoptosis［J］.Hum Mol Genet，2001，10：919-926.

［13］Orth M，Tabrizi SJ，Schapira AH，et al.Alpha-synuclein expression in HEK293 cells enhances the mitochondrial sensitivity to rotenone［J］.Neurosci Lett，2003，351：29-32.

［14］Elkon H，Don J，Melamed E，et al.Mutantand wild-type alphasynuclein interactwith mitochondrial cytochrome C oxidase［J］.J Mol Neurosci，2002，18：229-238.

［15］Cooper AA，Gitler AD，Cashikar A，et al.Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’smodels［J］.Science，2006，313：324-328.

［16］Smith WW，Jiang H，Pei Z，et al.Endoplasmic reticulum stress and mitochondrial cell death pathways mediate A53T mutant alpha synuclein-induced toxicity［J］.Hum Mol Genet，2005，14：3801-3811.

［17］Stokes AH，Hastings TG，Vrana KE.Cytotoxic and genotoxic potential of dopamine［J］.J Neurosci Res，1999，55：659 -665.

［18］Maguire-Zeiss KA，Short DW，F(xiàn)ederoff HJ.Synuclein，dopamine and oxidative stress：co-conspirators in Parkinson’s disease［J］?Brain Res Mol Brain Res，2005，134：18-23

［19］Junn E，Mouradian MM.Human alpha-synuclein over-expression increases intracellular reractive oxygenspecies levels and susceptibility to dopamine［J］.Neuorsci Lett，2002，320（3）：146-150.

［20］高寧，全熊志，陳煒，等.帕金森病a-Synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（5）：28-31.

［21］Gomez-Isla T，Irizarry MC，Mariash A，et al.Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic markers in humanα-synuclein A30P transgenic mice［J］.Neurobiology of Aging，2003，24（2）：245-258.

［22］Putten H，W iederhold KH，Probst A，et al.Neuropathology in mice expressing human alpha-synuclein［J］.JNeurosci，2000，20（16）：6021-6029

［23］Kahle PJ，Neumann M，Ozmen L，et al.Subcellular localization of wild-type and Parkinsons disease-associated mutantα -synuclein in human and transgenic mouse brain［J］.JNeurosci，2000，20：6365-6373

［24］Yamakado H，Moriwaki Y，Yamasaki N，et al.α-Synuclein BAC transgenic mice as a model for Parkinson＇s disease manifested decreased anxiety-like behavior and hyperlocomotion［J］.Neurosci Res，2012，73（2）：173-177.

［25］Lin X，Parisiadou L，Sgobio C，et al.Conditional Expression of Parkinson＇s Disease-Related Mutant alpha-Synuclein in the Midbrain Dopaminergic Neurons Causes Progressive Neurodegeneration and Degradation of Transcription Factor Nuclear Receptor Related 1［J］.J Neurosci，2012，32（27）：9248-9264.

［26］F.Lelan，L.Lescaudron，C.Boyer，et al.Effects of human alpha-synuclein A53T-A30Pmutations on SVZ and local olfactory bulb cell proliferation in a transgenic rat model of Parkinson disease［J］.Parkinson’s Disease，vol.2011，Article ID 987084，11 pages，2011.

［27］Kirik D，Rosenblad C，Burger C，et al.Parkinson-Like neurodegeneration induced by targeted overexpression ofαsynuclein in the nigrostriatal system［J］.The Journal of Neuroscience，2002，22（7）：2780-2791.

［28］Blesa J，Phani S，Jackson-Lewis V，et al.Classic and New Animal Models of Parkinson＇s Disease［J］.JBiomed Biotechnol，2012；2012：845618.

［29］Jackson-Lewis V，Blesa J，Przedborski S.Animal models of Parkinson＇s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2012，18 （Suppl 1）：S183-5.