鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法的建立及鑒定

任海濤，鐘志勇，鄭佳琳，饒子亮，鄺少松，王 剛，唐小江

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248）

鼠尾膠原蛋白是膠原蛋白的一種，主要為Ⅰ型膠原蛋白［1］。Ⅰ型膠原蛋白主要存在于真皮、腱、骨、牙本質(zhì)，以纖維形式形成膠原，由三股纏繞形成多肽鏈組［2］。作為一種新型生物材料，鼠尾膠原蛋白并不為眾人所知，但是其具有的諸多優(yōu)勢(shì)，如低抗原性、生物可降解性、優(yōu)越的生物相容性并有利于細(xì)胞貼附和遷移等特點(diǎn)［3］，為細(xì)胞增殖和功能分化提供了合適的微環(huán)境［4-5］，且它來(lái)源廣泛，成分單一，制備比較方便，是開發(fā)具有相關(guān)功能性生物醫(yī)療器械的好材料［6］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)膠原蛋白提取、分離、純化主要有中性鹽法［7］、酸提取法［8-9］、堿提取法［6-10］、酶法［11-12］等，但中性鹽法、酸提取法、堿提取法方法均存在著提取得率低，且操作復(fù)雜，還可能破壞膠原蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)［13］。酶法應(yīng)用較廣，但仍存在著純化困難的問(wèn)題。迄今為止，還沒有針對(duì)鼠尾膠原蛋白進(jìn)行大規(guī)模制備的相關(guān)研究的報(bào)道。

本研究的目的就是為了克服現(xiàn)有制備鼠尾膠原蛋白方法所存在的提取得率低、分離純化工藝復(fù)雜、沒有大規(guī)模生產(chǎn)方法等缺點(diǎn)，提供一種工藝簡(jiǎn)單、提取得率和純度高的鼠尾膠原蛋白的制備方法。為大量獲得鼠尾膠原蛋白并進(jìn)行更深層次的功效研究提供理論支持和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠鼠尾，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2008-0002；使用許可證號(hào)SYXK（粵）2008-0002］。

1.2 儀器與試劑

835-50型氨裁酸自動(dòng)分析儀（日本Hitachi公司）；J26XP大型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀（美國(guó)BIORAD公司）；130型制冰機(jī)（寧波新芝公司）； MIKRO20離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Sartorius公司）；RH basic 2磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）；SRM-CD47醫(yī)用保存柜（日本Sanyo公司）。

胃蛋白酶（Sigma公司）；醋酸、氯化鈉（廣州中南化工公司）、萬(wàn)級(jí)透析袋（廣州威佳公司）；Tris-HCl鹽、實(shí)驗(yàn)用水為18.2 mΩ超純水；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本研究所采用的新型“酸混合酶”法通過(guò)對(duì)提取、分離、純化鼠尾膠原蛋白的單因素參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到了更優(yōu)的擴(kuò)大化生產(chǎn)工藝參數(shù)。首先，剝?nèi)D大鼠尾腱需按照“從細(xì)到粗”的原則，在冰浴上進(jìn)行，避免鼠尾膠原蛋白變性。同時(shí)，應(yīng)將鼠尾軟骨在剝離前先自行擰成半斷裂狀，這樣可以最大限度的剝?nèi)∈笪搽?。再次，?duì)剝離的白色鼠尾腱應(yīng)立即放入含有0.05 mol/L Tris-HCl緩沖鹽的1 mol/ L NaCl溶液中處理24 h。以除去可溶性多糖、血液及其他雜質(zhì)等。提取鼠尾膠原蛋白的步驟如下：1.使用溶解有一定比例胃蛋白酶的酸溶液對(duì)初步處理的鼠尾腱進(jìn)行酶解，持續(xù)處理一段時(shí)間待混合物變成無(wú)色、透明、粘稠液體后即可在4℃，5000 g離心力下離心20 m in，收集上清即為粗制鼠尾膠原蛋白原液。2.將一定濃度的氯化鈉溶液加入其中，持續(xù)攪拌直至有白色絮狀沉淀從溶液中析出，繼續(xù)加入氯化鈉溶液至沉淀不在析出為止。4℃，5000 g離心力下離心20 m in后獲得白色沉淀。沉淀物加入一定濃度的酸溶液溶解。3、將溶解后的鼠尾膠原蛋白溶液繼續(xù)反復(fù)進(jìn)行鹽析處理，重復(fù)步驟2的過(guò)程2～4次。持續(xù)在超純水中透析3 d，每天換液3次以除去鼠尾膠原溶液中的無(wú)機(jī)鹽類，獲得的鼠尾膠原蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、氨基酸含量分析儀的鑒定，純度好。4、通過(guò)建立起來(lái)的提取方法，繼續(xù)對(duì)提取單因素進(jìn)行了優(yōu)化：

1.3.1 所用酸溶液的確定

不同酸溶液可以對(duì)酶解產(chǎn)生不同的影響，比較稀鹽酸、醋酸、檸檬酸這3種酸溶液用于提取鼠尾膠原蛋白，每種酸溶液加入用于提取的鼠尾腱1 g，其他實(shí)驗(yàn)條件一致。3種酸溶液濃度均為0.05 mol/ L，持續(xù)4℃攪拌72 h。最終在0.05 mol/L濃度下的稀鹽酸、醋酸、檸檬酸提取條件下，分別獲得鼠尾膠原0.27 g、0.43 g、0.38 g。故選用醋酸溶液作為提取參數(shù)條件。

1.3.2 所用酸溶液濃度的確定

在2.2.1的優(yōu)化前提下，繼續(xù)對(duì)提取所用的酸溶液濃度進(jìn)行了優(yōu)化，選用了0.025 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L這3個(gè)濃度。每個(gè)濃度酸溶液加入用于提取的鼠尾腱1 g，其他實(shí)驗(yàn)條件一致。分別獲得鼠尾膠原0.37 g、0.44 g、0.38 g。故選用0.05 mol/L濃度作為提取參數(shù)條件。

1.3.3 所用酶溶液濃度的確定

在酸溶液中胃蛋白酶可以發(fā)揮良好的酶解效果，但綜合成本和得率考慮需要對(duì)酶溶液濃度進(jìn)行探討。本研究使用1∶10000胃蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)，使用配比分別為于50 m L 0.05 mol/L醋酸溶液溶解10 mg、50 mg、100 mg、200 mg，加入用于提取的鼠尾腱1 g，其他實(shí)驗(yàn)條件一致。分別獲得鼠尾膠原0.27 g、0.34 g、0.44 g、0.45 g?？紤]到200 mg沒用量并沒有大幅度提供得率，故選用100 mg胃蛋白酶/50m L 0.05 mol/L醋酸溶液濃度（1∶500）作為提取參數(shù)條件。

1.3.4 所用酶作用時(shí)間的確定

時(shí)間是大規(guī)模生產(chǎn)上必須要考慮的一個(gè)問(wèn)題，本研究?jī)?yōu)化了酶解時(shí)間，分別選用酶解36 h、48 h、72 h、96 h，其他實(shí)驗(yàn)條件一致。每個(gè)提取時(shí)間加入用于提取的鼠尾腱1 g，獲得鼠尾膠原蛋白0.15 g、0.36 g、0.46 g、0.45 g。故選用酶解72 h作為提取參數(shù)條件。

1.3.5 所用氯化鈉濃度的確定

優(yōu)化了分級(jí)鹽析所用的氯化鈉濃度，分別選用1 mol/L、2 mol/L、4 mol/L，其他實(shí)驗(yàn)條件一致。每個(gè)提取時(shí)間配置用于提取的鼠尾腱1 g，獲得鼠尾膠原蛋白0.35 g、0.45 g、0.45 g。故選用2 mol/L作為提取參數(shù)條件。

2 結(jié)果

通過(guò)單因素條件優(yōu)化，獲得的最佳提取、分離、純化條件為：0.05 mol/L的醋酸，1∶500酶用量、酶解72 h、2 mol/L氯化鈉溶液分級(jí)鹽析。提高了提取鼠尾膠原蛋白的得率，為大批量生產(chǎn)鼠尾膠原蛋白打下了實(shí)踐基礎(chǔ)，提供了理論支持。經(jīng)SDS-PAGE電泳和氨基酸含量分析的鑒定，獲得的鼠尾膠原蛋白純度高。本研究簡(jiǎn)化了提取工藝，每條大鼠鼠尾（總重）平均約5 g，可以提取到干重為200 mg的鼠尾膠原蛋白，提取得率約為4％左右。較傳統(tǒng)的方法提取得率僅為0.2％，提取得率提高了20倍以上。

圖1 鼠尾膠原蛋白電泳圖Fig.1 Protein electrophoresis of rat tail collagen

電泳圖中，其中1～4道為5 mg/m L濃度，1、2道為SIGMA公司產(chǎn)品，3、4道為自制鼠尾膠原蛋白。5、6道為20 mg/m L濃度自制鼠尾膠原蛋白，7、8道為2.5 mg/m L濃度自制鼠尾膠原蛋白。

表1 鼠尾膠原蛋白氨基酸含量分析表Tab.1 Content analysis chart of amino acid in rat tail collagen

3 討論

傳統(tǒng)的提取鼠尾膠原蛋白的方法主要是中性鹽法、酸提取法、堿提取法、酶法等，但是均存在著不同程度的缺點(diǎn)。酸提取法提取迅速，但色氨酸全部被破壞，絲氨酸和絡(luò)氨酸部分被破壞；堿提取法造成膠原肽鍵被水解，含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞且產(chǎn)生消旋；中性鹽法造成肽鏈間的離子鍵會(huì)被鹽打開造成吸水膨脹，同時(shí)擴(kuò)大生產(chǎn)的工藝不穩(wěn)定；同時(shí)以上3種方法還存在著得率低的共同缺點(diǎn)，制約了鼠尾膠原蛋白的大規(guī)模提取。酶法反應(yīng)條件溫和，能保持膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)，但水解又不夠徹底。本研究所采用的新型“酸混合酶”法結(jié)合了酸提取法和酶法的優(yōu)勢(shì)，解決了單一方法提取過(guò)程中存在的固有缺陷，同時(shí)通過(guò)對(duì)提取、分離、純化鼠尾膠原蛋白的單因素參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使提取得率較傳統(tǒng)工藝提高了20倍以上。確定了工藝簡(jiǎn)單、操作方便、提取得率高的鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法。

本研究所提取的鼠尾膠原蛋白經(jīng)過(guò)鑒定：（1） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，其制備的鼠尾膠原蛋白與現(xiàn)有SIMGA公司的商業(yè)化鼠尾膠原蛋白進(jìn)行了對(duì)比，兩者圖譜無(wú)差異。從電泳結(jié)果上可以看出，制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高，純度好。其電泳結(jié)果一致。（2）樣品經(jīng)水解，經(jīng)高壓液相色譜檢驗(yàn)（樣品處理按GB/T 5009.124-2003水解，檢測(cè)方法按JY/T 024-1996），采用氨基酸分析儀，經(jīng)廣州市分析檢測(cè)中心對(duì)本研究中制備的鼠尾膠原蛋白進(jìn)行氨基酸含量分析表明，其含有①膠原蛋白特征氨基酸羥脯氨酸，含量約為8％左右；②不含胱氨酸、色氨酸這兩種氨基酸，與其自身特征相符；③甘氨酸含量接近總氨基酸含量的三分之一，與其自身特征相符。說(shuō)明制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高，達(dá)電泳純。為接下來(lái)鼠尾膠原蛋白的擴(kuò)大化生產(chǎn)提供了合適的工藝參數(shù)，為大量獲得鼠尾膠原蛋白這種生物可吸收材料并進(jìn)行更深層次的功效方面研究提供了理論支持和實(shí)踐基礎(chǔ)。

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