轉(zhuǎn)基因和基因敲除內(nèi)脂素對小鼠脂肪積累的對比研究

關(guān)菲菲，全雄志，朱 皓，高 珊，張曉娟，張連峰

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

內(nèi)脂素（visfatin）是從內(nèi)臟脂肪組織中分離出的一種脂肪因子［1］，經(jīng)基因序列比對發(fā)現(xiàn)該cDNA片段與前B細胞集落增強因子（pre-B cell colonyenhancing factor，PBEF）序列一致，PBEF在體內(nèi)作用是協(xié)同增強干細胞因子與白介素-7（IL-7）的作用促進前B細胞形成［2］；另外該蛋白還被歸屬為尼克酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（nicotinam ide phosphoribodyltransferase，Nampt）是哺乳動物體內(nèi)輔酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamid adenine dinucleotide，NAD）生物合成途徑中一個重要的限速酶［3］。除內(nèi)臟脂肪外，內(nèi)脂素在肝臟、胰腺、腎臟、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞及肌肉組織等均表達，研究表明其在糖代謝、肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合癥、心血管疾病、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和癌癥中都起到重要的作用［4，5］。

近年來，針對內(nèi)脂素與肥胖的關(guān)系開展了很多研究，結(jié)論仍然存在分歧，甚至是相悖的［6］。Haider等［7］對83名16歲以下的單純性肥胖兒童進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肥胖組兒童血漿visfatin濃度顯著高于正常體重兒童。Wang等［8］發(fā)現(xiàn)在雄性18～20周齡Lyon高血壓大鼠血液中內(nèi)脂素含量明顯高于對照Lyon正常大鼠，且與體重、脂肪總量、甘油三酯、總膽固醇等呈正相關(guān)。Araki等人對比調(diào)查了56位肥胖的日本兒童和20位不肥胖兒童的血漿內(nèi)脂素水平與皮下脂肪面積、內(nèi)臟脂肪面積、甘油三酯、胰島素等關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在排除了年齡和性別因素后，內(nèi)臟脂肪面積與血漿內(nèi)脂素含量呈顯著偏相關(guān)，血漿內(nèi)脂素水平是一個很好的證明內(nèi)臟肥胖的分子標記物［9］。而Pagano等［10］報道了相反的結(jié)果，在肥胖人群中血漿和脂肪組織中內(nèi)脂素的表達量均低于健康人群；Krzyzanowska等［11］，研究發(fā)現(xiàn)36名肥胖癥患者通過胃減容手術(shù)減肥后1年左右血漿內(nèi)脂素濃度明顯上升；Rongya Tao等［12］人發(fā)現(xiàn)Foxo1/Foxo3/Foxo4肝臟特異性的敲除小鼠（LTKO）中，內(nèi)脂素表達顯著下調(diào)，而肝中甘油三酯的積累增加，出現(xiàn)脂肪肝，同時，還利用腺病毒載體通過小鼠尾靜脈注射的方法，分別增強和下調(diào)了小鼠體內(nèi)內(nèi)脂素的表達量，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的肝中甘油三酯的積累降低了31％和增加了38％。Ping wang等［13］比較了40位非糖尿病普通人群和35位具有家族性高血脂病的非糖尿病人群血漿中內(nèi)脂素、甘油三酯、高密度膽固醇等一些生理生化指標，發(fā)現(xiàn)在普通人群中，血漿中visfatin含量與甘油三酯和內(nèi)臟脂肪細胞面積呈負相關(guān)，在具有家族性高血脂病的人群中內(nèi)脂素和甘油三酯的關(guān)系呈現(xiàn)相似的結(jié)果。

總之，內(nèi)脂素的作用究竟是脂肪組織積聚的原因還是抑制脂肪組織增長改善胰島素抵抗的結(jié)果，或者只是伴隨心血管疾病的一種偶然現(xiàn)象，目前尚無定論。很多實驗都是體外或者間接的證據(jù)，本研究是利用內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因和內(nèi)脂素基因敲除雜合子小鼠為研究對象，探討內(nèi)脂素與脂肪積累的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠由本所構(gòu)建［14］，雌性C57BL/6J野生鼠購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所康藍公司（SCXK-京2004—001），SYXK（京） 2009—0003。內(nèi)脂素基因敲除雜合子小鼠于2010年從日本引入本所（純合子小鼠胚胎致死）。以上3種小鼠選取雌性在2月齡時開始飼喂高脂飼料，高脂飼料能量組成為蛋白質(zhì)20％，脂肪35％，碳水化合物45％（購自康藍公司）。本實驗方案已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ILAS-GC-2012-001。

1.2 脂肪總重量測定

9月齡時頸椎脫臼處死小鼠，小心剝離皮下脂肪和腹腔脂肪，并稱重。

1.3 Westernblot鑒定內(nèi)脂素蛋白的表達

內(nèi)脂素蛋白的表達分析按文獻進行［15］，提取內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠和同月齡野生鼠以及內(nèi)脂素敲除雜合子小鼠內(nèi)臟脂肪總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上（Millipore，美國），置于5％脫脂奶粉中封閉，兔抗內(nèi)脂素多克隆抗體檢測內(nèi)脂素蛋白表達水平（BioVison，美國），辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗兔抗體結(jié)合一抗（Pierce，美國），HRP偶聯(lián)的鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體作為內(nèi)參（康成生物，中國）。

1.4 MRI成像

MRI成像采用Varian公司生產(chǎn)的7T/160 mm孔徑的小動物磁共振成像系統(tǒng)，將動物用2％異氟烷與氧氣混合氣進行麻醉，用體線圈進行采集和接收。由于腹部呼吸運動會產(chǎn)生偽影，采集過程中用呼吸門控控制信號的采集。本實驗選擇SE（自旋回波序列）T1W I分別對內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠、同月齡野生鼠和部分內(nèi)脂素基因敲除小鼠行冠狀位和橫斷位掃描，冠狀位掃描參數(shù)：TR（重復時間）/TE（回波時間）：230 ms/16 ms；FOV（視野）：70 mm×45 mm；層厚：1 mm；層間距：1 mm；疊加次數(shù)：4；掃描矩陣：256×256；總掃描時間：3 m in 55 s。橫斷位掃描參數(shù)：FOV：40 mm×45 mm，其它參數(shù)同前。

1.5 小鼠腹腔脂肪組織學觀察

頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開腹腔取出腹腔脂肪，將脂肪組織固定在中性福爾馬林中24 h，脫水，石蠟包埋及切片，HE染色后顯微鏡下觀察（Laica顯微鏡，德國）組織學變化。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以Mean±S.E.M.表示，用Student＇s t-tests或one-way ANOVA分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因、野生和基因敲除小鼠腹腔脂肪內(nèi)脂素的表達

分別提取2月齡內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠（TG），野生鼠（WT）和內(nèi)脂素基因敲除雜合子（KO（+/-））雌性小鼠脂肪組織總蛋白，Western blot分析內(nèi)脂素在腹腔脂肪組織中的表達（圖1a）。利用Image J軟件，GADPH作為內(nèi)參，密度掃描定量分析結(jié)果顯示，內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中內(nèi)脂素的表達量比野生小鼠增加37％，基因敲除雜合子小鼠比野生小鼠降低了55％（圖1b）。2月齡時，3種小鼠在體重、血清總膽固醇和高密度膽固醇含量上沒有區(qū)別，而在空腹血糖、甘油三酯和低密度膽固醇含量上，內(nèi)脂素基因敲除雜合子小鼠要高于野生鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠（表1）。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)3種小鼠血清中內(nèi)脂素的水平?jīng)]有顯著差異（未顯示）。

圖1 內(nèi)脂素在脂肪組織的表達注：分別提取2月齡內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠（TG），野生鼠（WT）和內(nèi)脂素基因敲除雜合子雌性小鼠（KO-/+）脂肪組織總蛋白，a，Western blot分析內(nèi)脂素在腹腔脂肪組織中的表達，b，GAPDH作為內(nèi)對照，密度掃描定量Fig.1 The expression of Visfatin in the visceral fat tissueNote：The total lysates of visceral fat tissues were isolated from visfatin transgenic mice（TG），wild type mice（WT）and heterozygous visfatin+/-mice（KO+/-）at2 months of age.a，the expression of visfatin in the visceral fat tissue；b，the quantitative analysis of the expression of visfatin using GAPDH for normalization

表1 2月齡內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因、野生和敲除小鼠體重及基礎(chǔ)血生化Tab.1 Body weight and blood biochemical parameters of visfatin TG，WT and KO+/-2-month-old mice

圖2 小鼠的體重變化分析注：內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因（TG），野生（WT）和內(nèi)脂素基因敲除雜合子（KO+/-）雌性小鼠飼以高脂飼料，自由采食，分別在2，4，6，8，9月齡測定其體重（n≥9）Fig.2 The change of body weight in miceNote：TG，WT and KO+/-female mice were given high fat diet，ad libitum feeding，the body weightwas determined at 2，4，6，8，9 month age（n≥9）

2.2 內(nèi)脂素表達對小鼠體重的影響

內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因，野生和內(nèi)脂素基因敲除雜合子雌性小鼠從2月齡開始，飼喂高脂飼料，分別在2，4，6，8，9月測定其體重（圖2）。結(jié)果表明，2月齡時，內(nèi)脂素基因敲除雜合子雌性小鼠略大于野生小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠，隨著高脂飼料的飼喂和年齡的增長，在測定終點9月齡時，轉(zhuǎn)基因小鼠體重平均27.8±0.8 g，野生小鼠體重平均33.6±1.1 g，基因敲除雜合子小鼠體重平均37.6±1.9 g。

2.3 內(nèi)脂素表達對小鼠脂肪積累的影響

9月齡時，采用7T/160 mm孔徑的小動物磁共振成像系統(tǒng)（varian）分別對內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因，野生和內(nèi)脂素基因敲除雜合子雌性小鼠進行冠狀位和橫斷位掃描（圖3b，3c），圖中白色部分為高反射的脂肪組織，結(jié)果顯示內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪組織面積最小，其次是野生鼠，基因敲除雜合子雌性小鼠的面積最大。分別剝離皮下脂肪和腹腔脂肪組織，稱重，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠的皮下和腹腔脂肪總重量比野生小鼠降低了40％，基因敲除雜合子小鼠的脂肪總重量比野生小鼠增加了37％。對比體重變化，內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠體重與野生小鼠比，平均減少5.8 g，脂肪重量平均減少3.2 g；基因敲除雜合子小鼠體重與野生小鼠比，平均增加了4.0 g，脂肪重量平均增加3.0 g，由此可見轉(zhuǎn)基因，野生和基因敲除雜合子的體重差異主要是由于脂肪積累不同所導致的。結(jié)合Western blot顯示的3種小鼠內(nèi)脂素表達量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素的表達量越高，體重越輕，皮下和腹腔脂肪總重量也越小。由此說明小鼠體重及皮下和腹腔脂肪總重量與內(nèi)脂素的表達呈負相關(guān)。

2.3 內(nèi)脂素表達對小鼠脂肪組織形態(tài)的影響

腹腔脂肪H＆E染色發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪細胞面積最小，其次是野生鼠，基因敲除雜合子雌性小鼠脂肪細胞的面積最大（圖4）。利用ScanScope軟件比較3種小鼠脂肪細胞大小，結(jié)果顯示內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪細胞平均大小比野生小鼠減少47％，內(nèi)脂素基因敲除雜合子小鼠的脂肪細胞平均比野生小鼠增加了67％，結(jié)合western blot顯示的3種小鼠內(nèi)脂素表達量的關(guān)系，說明腹腔脂肪細胞大小與內(nèi)脂素表達呈負相關(guān)。

圖3 小鼠脂肪組織定量分析注：內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因（TG），野生（WT）和內(nèi)脂素基因敲除雜合子（KO+/-）雌性小鼠飼以高脂飼料，自由采食。a，3種小鼠皮下脂肪和腹腔脂肪組織的總重量比較（n≥9）。b，9月齡利用核磁成像對小鼠的橫斷面掃描圖。c，9月齡利用核磁成像對小鼠的冠狀面掃描圖，其中箭頭所示白色部分為高反射的脂肪組織Fig.3 The quantitative analysis in visceral fat tissue ofmiceNote：TG，WT and KO（+/-）femalemice were given high fat diets，ad libitum feeding，（a）The weight of visceral fat（n≥9）；（b）Axial views of MRI，（c）Coronal views of MRI，the part ofwhite stands for adipose tissue（arrows）

圖4 腹腔脂肪組織的組織學觀察注：在9月齡采集內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因（TG），野生（WT）和內(nèi)脂素基因敲除雜合子（KO+/-）雌性小鼠腹腔脂肪組織，進行常規(guī)H＆E染色和光鏡觀察（100×）Fig.4 Histopathology observation of visceral adipose tissueNote：Hematoxylin-eosin（H＆E）staining patterns of the female TG，WT and KO（+/-）visceral adipose tissue，opticalmicroscope were observed（100×）

3 討論

近年來，關(guān)于內(nèi)脂素與肥胖的關(guān)系，有很多研究報道，尤其是針對肥胖的女性［16-19］，然而作用效果存在爭議。在實驗中同時選擇了雌雄鼠為研究對象，但結(jié)果只顯示雌鼠在脂肪積累上有顯著差異（雄鼠結(jié)果未顯示）。實驗中利用內(nèi)脂素表達量不同的3種小鼠：內(nèi)脂素轉(zhuǎn)基因小鼠、野生小鼠和內(nèi)脂素基因敲除雜合子小鼠，從體重、腹腔和皮下脂肪總重量以及腹腔脂肪細胞的大小3個角度考察了內(nèi)脂素與脂肪積累的關(guān)系，結(jié)果證實，內(nèi)脂素表達量與體重、皮下和內(nèi)臟脂肪總重量及脂肪細胞大小呈負相關(guān)。此結(jié)果與Krzyzanowska及Rongya Tao等［10-13］報道一致，Rongya Tao等［20，21］研究表明內(nèi)脂素與脂肪積累關(guān)系是通過調(diào)節(jié)去乙酰化酶（sirtuin）的活性來完成的。內(nèi)脂素也被稱為尼克酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltansferase，Nampt），是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成路徑中重要的限速酶，NAD+水平的高低直接影響去乙?；傅幕钚?，而該酶是調(diào)控脂代謝的關(guān)鍵酶。體內(nèi)NAD+水平降低，去乙?；富钚越档?，引起與脂合成相關(guān)的酶類表達水平降低，從而減少了脂肪積累［12］。從我們的實驗結(jié)果可以看出，內(nèi)脂素并非是引起肥胖的原因，高表達時可以抑制脂肪積累。

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