GFP轉(zhuǎn)基因裸鼠脾臟組織學(xué)觀察

方 天，尤金煒，張立波，陳 濤，田小蕓，劉 彪，吳正林，許龍祥，周森妹，趙志剛，惲?xí)r鋒

（1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國(guó)科普教育基地，南京 210002； 2.江蘇省金壇市金城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，金壇 213200）

BALB/c裸小鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，目前已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。特別是在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面，它有著特殊的價(jià)值［1］。目前已將nu基因?qū)氩煌幌祫?dòng)物，成為系列動(dòng)物模型，我國(guó)所應(yīng)用的自發(fā)性免疫缺陷小鼠，主要應(yīng)用的是BALB/c遺傳背景的裸鼠。

BALB/c熒光裸鼠是將GFP基因?qū)隑ALB/cnu/nu小鼠而得。來(lái)源于水母（aequorea victoria）的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），現(xiàn)已成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一。熒光成像具有簡(jiǎn)單操作、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，在活體動(dòng)物體內(nèi)成像中可得到廣泛應(yīng)用［2-5］。GFP轉(zhuǎn)基因裸鼠因自身含有標(biāo)記蛋白與普通裸鼠相比而具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但在飼養(yǎng)以及繁殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，熒光裸鼠繁殖率低、存活率、免疫力低下，更難獲得適宜于實(shí)驗(yàn)的熒光裸鼠。這一現(xiàn)象與外源GFP基因?qū)π∈蟀l(fā)育存在一定毒性的報(bào)道不謀而合［6］。本實(shí)驗(yàn)所選用的熒光裸鼠均為本科室工作人員通過(guò)多年雜交選育工作取得，選育方法：選擇自帶GFP轉(zhuǎn)基因的C57BL/6小鼠與BALB/c裸鼠雜交，并與BALB/c裸鼠回交并經(jīng)逐代選育，選育至第六代，產(chǎn)生了GFP基因表達(dá)較為穩(wěn)定的BALB/c綠色熒光裸鼠。C57BL/6中插入的GFP綠色熒光蛋白基因序列號(hào)為：GenBank L29345.1，同時(shí)轉(zhuǎn)入雞β-actin啟動(dòng)子序列；原始導(dǎo)入的外源基因：包括GFP基因，和控制其表達(dá)的promoter（chicken beta-actin promoter），同時(shí)轉(zhuǎn)入巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子，增強(qiáng)GFP基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用這兩種動(dòng)物模型，觀察熒光裸鼠隨日齡增長(zhǎng)脾臟組織學(xué)變化與否，并探討GFP基因的導(dǎo)入對(duì)裸鼠的脾臟發(fā)育、組織學(xué)形態(tài)以及功能是否有影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)不同日齡（14日齡、28日齡、49日齡、70日齡）BALB/c熒光裸鼠32只，每個(gè)特定日齡階段取8只，雌雄各半；以及不同日齡（14日齡、28日齡、49日齡、70日齡）BALB/c普通裸鼠32只，每個(gè)日齡階段取8只，雌雄各半。BALB/c熒光裸鼠和BALB/c普通裸鼠均由本科室工作人員選育，本科室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（軍） 2007—029；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（軍） 2007—012。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與研究指標(biāo)

1.2.1 脾臟絕對(duì)重量和脾臟指數(shù)的測(cè)定

每組動(dòng)物按在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的日齡處死，稱重，無(wú)菌條件下取出脾臟稱重。用小鼠脾臟的重量除以各自體重，求相對(duì)濕重即為脾臟指數(shù)，以mg/g表示。

1.2.2 光鏡觀察

脾臟組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察脾臟組織形態(tài)差異。計(jì)算并比較各組切片淋巴細(xì)胞數(shù)：用目鏡測(cè)微尺為標(biāo)線，以脾中央小動(dòng)脈為中點(diǎn)，分別計(jì)算壓在標(biāo)線上兩邊的淋巴細(xì)胞數(shù)，求均數(shù)為一個(gè)中央小動(dòng)脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞數(shù)，按同樣方法計(jì)算3個(gè)脾中央小動(dòng)脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)即為脾中央小動(dòng)脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞數(shù)［11］。

1.2.3 熒光顯微鏡下觀察

28日齡熒光裸鼠的脾臟取出后制作成冰凍切片用熒光顯微鏡在480 nm激發(fā)光下進(jìn)行觀察；14日齡、28日齡、49日齡、70日齡熒光裸鼠無(wú)菌條件下取出脾臟后立即用熒光顯微鏡在480 nm激發(fā)光下進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

熒光裸鼠與普通裸鼠體重、脾臟絕對(duì)重量和脾臟指數(shù)經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，同一日齡熒光裸鼠與裸鼠之間體重、脾臟絕對(duì)重量和脾臟指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光裸鼠組各日齡階段比較結(jié)果如下：與14日齡組熒光裸鼠比較，28日齡組體重、脾臟絕對(duì)重量和脾臟指數(shù)明顯增大（P＜0.05）；49日齡組體重、脾臟絕對(duì)重量明顯增大（P＜0.05），但脾臟指數(shù)差異不顯著；70日齡組體重、脾臟絕對(duì)重量明顯增大（P＜0.05），脾臟指數(shù)差異也不顯著（表1）。

各日齡階段脾臟切片HE染色結(jié)果：在光學(xué)顯微鏡下觀察普通裸鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰明顯，白髓與紅髓界限較明顯，脾小結(jié)、中央動(dòng)脈和動(dòng)脈周圍淋巴鞘清晰可見(jiàn)，淋巴細(xì)胞密集。同一日齡階段的熒光裸鼠與普通裸鼠相比，14日齡、28日齡、49日齡、70日齡熒光裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)較少，淋巴細(xì)胞密度稀疏；并含有更多脾小動(dòng)脈（彩插1圖1）。熒光裸鼠各組別間進(jìn)行比較結(jié)果是：與14日齡熒光裸鼠相比，49日齡、70日齡熒光裸鼠淋巴細(xì)胞數(shù)較少、淋巴細(xì)胞密度較低（彩插1圖1、圖2、表2）。

表1 熒光裸鼠脾臟絕對(duì)重量和脾臟指數(shù)Tab.1 The weight of spleen and the spleen index in nude mice with GFP

表2 熒光裸鼠、普通裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)Tab.2 The sum of lymphocyte cells in nudemice with GFP and nude m ice

28日齡熒光裸鼠脾臟冷凍切片觀察結(jié)果：被膜厚，綠色熒光蛋白表達(dá)明顯，熒光光線亮、熒光強(qiáng)度強(qiáng)，白髓結(jié)構(gòu)多而典型且熒光亮度更亮，紅髓結(jié)構(gòu)熒光強(qiáng)度稀疏，移行區(qū)明顯（彩插2圖3）。14日齡、28日齡、49日齡、70日齡熒光裸鼠脾臟實(shí)體觀察結(jié)果：脾臟內(nèi)綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)持續(xù)穩(wěn)定，且表達(dá)量較多；其中心熒光強(qiáng)度最大，并呈散射狀向四周擴(kuò)散（彩插2圖4）。

3 討論

脾臟由白髓、邊緣區(qū)和紅髓組成，在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中起到了重要作用。白髓是淋巴細(xì)胞密集的區(qū)域，由脾小體和動(dòng)脈周鞘組成，其中脾小體是B淋巴細(xì)胞密集的區(qū)域，機(jī)體免疫功能活躍時(shí)，脾小體中可出現(xiàn)生發(fā)中心，動(dòng)脈周鞘是T淋巴細(xì)胞密集的區(qū)域。邊緣區(qū)是白髓向紅髓移行的區(qū)域，含有大量的巨噬細(xì)胞和一些T、B細(xì)胞，以B細(xì)胞較多。邊緣區(qū)最先接受抗原刺激并發(fā)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所［7-9］。當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，抗原經(jīng)巨噬細(xì)胞加工處理后，在T細(xì)胞的協(xié)同作用下，脾小體的B淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生大量的效應(yīng)B細(xì)胞，B細(xì)胞可分化為漿細(xì)胞分泌抗體，參與體液免疫［10-11］。本實(shí)驗(yàn)中，28日齡熒光裸鼠脾臟指數(shù)明顯高于14日齡熒光裸鼠、49日齡熒光裸鼠和70日齡熒光裸鼠（p＜0.05，表1），這表明脾臟在14日齡到28日齡之間生長(zhǎng)發(fā)育速度快，而28日齡后則基本停止脾臟個(gè)體發(fā)育；反映脾臟生長(zhǎng)發(fā)育的變化趨勢(shì)。

14日齡熒光裸鼠脾臟白髓較少，其淋巴細(xì)胞密度不高，并且移行區(qū)不明顯（彩插1圖1a）；28日齡熒光裸鼠的白髓結(jié)構(gòu)多而典型，淋巴細(xì)胞密度較大，移行區(qū)明顯（彩插2圖3）；49日齡和70日齡熒光裸鼠的白髓結(jié)構(gòu)有的不規(guī)則，有的較松散或僅有少量淋巴細(xì)胞組成，移行區(qū)不明顯，紅髓區(qū)淋巴細(xì)胞索結(jié)構(gòu)突出（彩插1圖2e；圖2g）。脾臟作為機(jī)體接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫反應(yīng)的場(chǎng)所，其組織學(xué)變化反映了機(jī)體免疫功能的改變。白髓結(jié)構(gòu)典型與否和機(jī)體受到的抗原刺激有關(guān)，隨增齡，機(jī)體受到的抗原刺激增多，免疫應(yīng)答能力增強(qiáng)，脾小結(jié)內(nèi)含分化活躍的B細(xì)胞，移行區(qū)作為脾臟-血液淋巴細(xì)胞再循環(huán)的通道，可及時(shí)動(dòng)員有免疫活性的淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用［12］。

脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官［13］，脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量多少可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的高低［14-15］。與普通裸鼠相比，同一日齡熒光裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)較少、淋巴細(xì)胞密度稀疏（P＜0.05）；熒光裸鼠不同日齡組之間比較結(jié)果，28日齡之后，隨日齡增長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞數(shù)呈減小趨勢(shì)（P＜0.05）（表2）。這從一定程度上說(shuō)明：熒光裸鼠與同一日齡的普通裸鼠相比較，免疫功能更為低下；并且熒光裸鼠隨日齡增長(zhǎng)，免疫功能有下降趨勢(shì)。熒光裸鼠持續(xù)高表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP，彩插2圖4）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映外源基因GFP基因會(huì)對(duì)脾臟形態(tài)及其功能產(chǎn)生一定的影響。關(guān)于外源導(dǎo)入基因如何影響熒光裸鼠脾臟形態(tài)及其功能的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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