晚期糖基化終產(chǎn)物對大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶p22phox亞基及活性氧表達(dá)的影響

劉亞洋，李鶴，吳宗貴，湯錫友

晚期糖基化終產(chǎn)物對大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶p22phox亞基及活性氧表達(dá)的影響

劉亞洋，李鶴，吳宗貴，湯錫友

目的:探討晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)對大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶p22phox亞基及活性氧表達(dá)的影響。

方法:用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠的血管外膜成纖維細(xì)胞，用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡檢測不同濃度的糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA，分為對照組、100μg/m l AGE-HSA組，200μg/ml AGE-HSA組、300μg/m l AGE-HSA組)對NADPH氧化酶p22phox亞基信使核糖核酸(mRNA)及蛋白的表達(dá)的影響，并觀察不同干預(yù)因素［分為對照組1、200μg/ml AGE-HSA組(200μg/ml處理組1)、200μg/ml AGE-HSA+50μg/ml抗RAGE中和抗體組(抗RAGE中和抗體組1)及200μg/ml AGE-HSA+30 nmol/L坎地沙坦組(坎地沙坦組1)對AGE-HSA上調(diào)NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響。用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽檢測不同干預(yù)因素［空白對照組、AGE-HSA 200μg/ml組(200μg/ml處理組2)、200μg/ml AGE-HSA+50μg/ml抗RAGE中和抗體組(抗RAGE中和抗體組2)、200μg/ml AGE-HSA+30μmol/L夾竹桃素組(夾竹桃組)，200μg/ml AGE-HSA+30 nmol/L坎地沙坦組(坎地沙坦組2)對血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)的影響。

結(jié)果:3個濃度(100μg/ml、200μg/ml和300μg/ml)的AGE-HSA組均與對照組比較，血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA及蛋白的表達(dá)隨AGE-HSA增加呈濃度依賴性上調(diào);抗RAGE中和抗體組1、坎地沙坦組1比200μg/m l處理組1的p22phoxmRNA及蛋白表達(dá)降低;抗RAGE中和抗體組2、夾竹桃素組2及坎地沙坦組2比200μg/ml AGE-HSA處理組2血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧相對熒光強(qiáng)度降低，上述比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

結(jié)論:AGE-HSA經(jīng)由RAGE影響活性氧與NADPH氧化酶p22phox亞基的表達(dá)上調(diào)，活性氧的上調(diào)與NADPH氧化酶p22phox亞基表達(dá)相關(guān)。NADPH氧化酶抑制劑及坎地沙坦可通過下調(diào)NADPH氧化酶p22phox亞基的表達(dá)減少血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。

晚期糖基化終產(chǎn)物;晚期糖基化終產(chǎn)物受體;血管外膜成纖維細(xì)胞;NADPH氧化酶;p22phox

Objective:To investigate the effect of advanced glycation end products(AGE)on NADPH oxidase subunit p22phox expression and reactive oxygen species(ROS)production in vascular adventitial fibroblasts(VAF)in rats.

Methods:The isolated VAF of SD ratswere cultured with the adherent tissue explantsmethod.①The effectof AGE-HSA on p22phoxmRNA and protein expression weremeasured by RT-PCR and Western-blotwith different concentrations of AGE-HSA at 100 μg/ml，200 μg/ml，300 μg/ml and Control group respectively. ②The effect of different reagents on AGE-HSA regulating p22phoxmRNA and protein expression were conducted as200 μg/m l AGE-HSA group，200 μg/ml AGE-HSA+anti-RAGE neu-tralizing antibody group，and 200μg/ml AGE-HSA+Candesartan group.③The effectof different reagents on ROSproduction in AF weremeasured by ROSassay kit as 200 μg/m l AGE-HSA group，200 μg/m l AGE-HSA+anti-RAGE neutralizing antibody group，200 μg/ml AGE-HSA+Apopcin group，and 200 μg/m l AGE-HSA+Candesartan group.

Results:①Compared with Control group，p22phoxmRNA and protein expression were up-regulated by AGE-HSA in a dosedependentmanner.②Compared with 200μg/m l AGE-HSA group，p22phoxmRNA and protein expression decreased in 200μg/ml AGE-HSA+anti-RAGE neutralizing antibody group and 200μg/ml AGE-HSA+Candesartan group.③Compared with 200 μg/ml AGE-HSA group，the ROS production in VAF decreased in 200 μg/ml AGE-HSA+anti-RAGE neutralizing antibody group，200 μg/ml AGE-HSA+Apopcin group，and 200 μg/m l AGE-HSA+Candesartan group.All P＜0.05.

Conclusion:ThemRNA and protein expression of p22phox，the ROS production in VAF were up-regulated by AGE-HSA in rats，and those effects could be inhibited by RAGE.NADPH oxidase inhibitors and candesartan can reduce ROSby down-regulating p22phox expression.

(Chinese Circulation Journal，2012，27:228.)

氧化應(yīng)激是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［1，2］，它與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。糖尿病患者血管組織中的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)逐漸堆積，AGE-糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)-氧化應(yīng)激軸參與了糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生過程［3］。血管外膜成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生誘發(fā)外膜炎癥，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶作為活性氧的調(diào)控酶，其亞基p22phox在多種組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著樞紐性作用。本研究探討AGE對血管NADPH氧化酶p22phox亞基表達(dá)的影響，并觀察RAGE中和抗體、坎地沙坦等干預(yù)因素對血管外膜成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動物及材料:2008-10至2009-10選擇6周齡清潔級健康雄性SD大鼠8只，體重(200±6.5)g(上海市中科院動物中心提供，合格證號:中科院動管會第005號)。材料:改良 Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、總核糖核酸(RNA)提取試劑(Trizol，美國Gibco公司)，培養(yǎng)皿(美國Corning公司)，糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA，美國Sigma公司)。氧化酶抑制劑夾竹桃素(德國默克公司)。2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針(江蘇碧云天公司)。SYBR Green熒光染料(美國Molecular Probes公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海康成生物工程公司)。小鼠抗大鼠Phospho-p22 phox單克隆抗體(美國，R＆D公司)，小鼠抗RAGE抗體，辣根過氧化物酶—抗小鼠-IgG(美國Santa Cruz生物技術(shù)公司)。

方法:血管外膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng):10周齡雄性SD大鼠，取胸主動脈，剝?nèi)⊥饽?，將其剪成約1 mm3左右的小塊，把每小塊組織均勻貼于培養(yǎng)皿底部，用含10%小牛血清的DMEM液培養(yǎng)，免疫組化鑒定，Vimentin單抗染色陽性，α肌動蛋白單抗染色陰性，即為所需血管外膜成纖維細(xì)胞，純度達(dá)98%。生長接近融合時按1∶3傳代，實(shí)驗(yàn)使用3～5代細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)分組:①AGE-HSA對血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox亞基表達(dá)的影響:通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出有效藥物濃度。按血管外膜成纖維細(xì)胞中添加不同濃度的 AGE-HSA，分為對照組(0μg/ml AGE-HSA)、100 μg/ml AGE-HSA 組、200 μg/ml AGEHSA組和300μg/ml AGE-HSA組，刺激24 h后進(jìn)行檢測。②干預(yù)因素對AGE-HSA上調(diào)NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響:分為對照組1(0μg/m l AGE-HSA)、200μg/ml處理組1(200μg/ml AGE-HSA)、抗RAGE中和抗體組1(200μg/ml AGEHSA+50μg/ml抗 RAGE中和抗體)、坎地沙坦組1(200μg/ml AGE-HSA+30 nmol/L坎地沙坦)。③干預(yù)因素對血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響:同步化的血管外膜成纖維細(xì)胞分空白對照組、200μg/ml處理組2(AGE-HSA 200μg/ml)、抗RAGE中和抗體組2(200μg/ml AGE-HSA+50μg/ml抗RAGE中和抗體)、坎地沙坦組2(200μg/m l AGE-HSA+30 nmol/L坎地沙坦)和夾竹桃素組(200μg/m l AGE-HSA+30μmol/L夾竹桃素)，加入干預(yù)因素預(yù)孵育1 h后加入200μg/ml AGE-HSA共同孵育23 h，檢測活性氧。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox亞基信使核糖核酸(mRNA)表達(dá):NADPH氧化酶p22phox亞基基因序列擴(kuò)增的上游引物序列:5’-GCT CAT CTG TCT GCT GGA GTA-3’;下游引物序列:5’-ACG ACC TCA TCT GTA ACT GGA-3’，擴(kuò)增片段為435 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

蛋白質(zhì)印跡:生長達(dá)融合狀態(tài)的細(xì)胞同步化后經(jīng)各干預(yù)因素預(yù)處理45 min后加AGE刺激24 h。分別收集上述細(xì)胞，提取總蛋白，行蛋白質(zhì)印跡檢測。

2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧:將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，各孔中加入玻片，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合時，0.25%胰酶消化，用緩沖液PBS洗滌后制成3×105/m l的單細(xì)胞懸液;待細(xì)胞長滿后，用37℃預(yù)溫的緩沖液PBS洗細(xì)胞1次，然后與終濃度為10μmol/L的熒光染料DCFH-DA在37℃條件下避光孵育30 min;緩沖液PBS洗2次，室溫下靜置5 min;熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

2 結(jié)果

AGE-HSA對血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA及蛋白表達(dá)影響:血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶亞基p22phox mRNA的表達(dá)，100 μg/mlAGE-HSA 組(1.32±0.21)、200 μg/ml AGE-HSA組(2.65±0.23)及300 μg/mlAGE-HSA 組(2.83±0.20)與對照組(1.00)比較，隨AGE-HSA濃度NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA表達(dá)增加呈濃度依賴性上調(diào);200μg/ml AGE-HSA組比100μg/ml AGE-HSA組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)(P＜0.05)。圖1A。血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox亞基蛋白的表達(dá)，100 μg/ml AGE-HSA 組(2.45±0.18)、200 μg/ml AGE-HSA組(4.21±0.15)及 300μg/ml AGE-HSA組(4.38±0.10)與對照組(1.00)比較，隨AGE-HSA濃度增加其表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào)，200μg/ml AGE-HSA組比100μg/ml AGE-HSA組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。200μg/ml AGE-HSA組與 300μg/ml AGEHSA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。圖1B

不同干預(yù)因素對AGE-HSA上調(diào)NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響:NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA表達(dá)200μg/ml處理組1(2.65±0.22)比對照組1(1.00)增強(qiáng);抗RAGE中和抗體組1(1.02±0.14)、坎地沙坦組1(0.98±0.12)比200 μg/ml處理組1(2.65±0.22)降低。圖2A。NADPH氧化酶p22phox亞基的蛋白表達(dá)200μg/ml處理組1(4.33±0.23)比對照組1(1.00)增強(qiáng);抗RAGE中和抗體組1(1.01±0.14)、坎地沙坦組1(0.99±0.13)比200 μg/ml處理組1(4.33±0.23)降低，圖2B。上述比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 不同AGE-HSA對血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響(n=3)1A NADPH氧化酶p22phox亞基mRNA的表達(dá) 1B NADPH氧化酶p22phox亞基蛋白的表達(dá) 1:對照組;2:100μg/ml AGE-HSA組;3:200μg/ml AGE-HSA組;4:300μg/ml AGE-HSA組 與對照組比較*P＜0.05;3組與2組比較△P＜0.05 圖2 不同干預(yù)因素對AGE-HSA上調(diào)血管外膜成纖維細(xì)胞p22phox表達(dá)的影響(n=3)2A 逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)分析結(jié)果 2B 蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果 1’:對照組1;2’:200μg/ml has處理組1;3’:抗RAGE中和抗體組1;4’:坎地沙坦組1 與對照組比較*P＜0.05 與2組比較△P＜0.05 β-actin:β-肌動蛋白 AGEHSA:糖基化人血清白蛋白 mRNA:信使核糖核酸

不同干預(yù)因素對血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響:200μg/ml處理組2(2.62±0.31)比空白對照組(1.00)血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧相對熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);抗RAGE中和抗體組2(0.73±0.33)、夾竹桃素組(0.82±0.20)、坎地沙坦組2(0.93±0.31)比200 μg/ml處理組2(2.62±0.31)血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧相對熒光強(qiáng)度降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前，關(guān)于AGE對血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶及活性氧的影響較少報道，本研究就以此為著眼點(diǎn)進(jìn)行探討，揭示其影響機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，AGE-HSA可使血管外膜成纖維細(xì)胞的NADPH氧化酶p22phox亞基表達(dá)增加，從而促使NADPH氧化酶激活。RAGE中和抗體、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)類坎地沙坦預(yù)處理均可起到抑制AGE所致NADPH氧化酶亞基p22phox上調(diào);RAGE中和抗體可部分阻斷AGE與RAGE的結(jié)合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AGE可能通過RAGE影響NADPH氧化酶p22phox亞基，從而影響氧化應(yīng)激。研究還發(fā)現(xiàn)，AGEHSA可上調(diào)血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。NADPH氧化酶拮抗劑、RAGE中和抗體、坎地沙坦可抑制活性氧的產(chǎn)生。AGE可能通過AGE-RAGE-氧化應(yīng)激途徑發(fā)揮重要生理作用。研究結(jié)果提示阻斷AGE-RAGE交互作用，抑制AGE產(chǎn)生，抑制RAGE表達(dá)以及干預(yù)其下游通路等可抑制AGE所致氧化應(yīng)激。

NADPH氧化酶是體內(nèi)重要的氧化酶，參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程［3］。NADPH氧化酶p22phox亞基蛋白作為NADPH氧化酶的亞單位，在維持酶活性和合成活性氧的過程中起關(guān)鍵作用［4，5］，活性氧是調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的重要信號分子，介導(dǎo)對其敏感的轉(zhuǎn)錄因子及炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)動脈粥樣硬化病變形成［6，7］。夾竹桃素通過抑制 NADPH氧化酶各亞基的聚集而特異性抑制該酶的活性，減少活性氧的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的程度。本研究發(fā)現(xiàn)夾竹桃素可抑制 AGE所致活性氧表達(dá)增加，阻斷 AGERAGE-氧化應(yīng)激信號通路可減少活性氧的表達(dá)。AGE發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)主要由RAGE介導(dǎo)，和RAGE相互作用后激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生活性氧，并引起核因子NF-κB的激活，NF-κB的激活可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種損傷因子。這即為AGE-RAGE-氧化應(yīng)激軸的作用機(jī)制。Yamagishi等［8］指出糖尿病血管并發(fā)癥是一種加速的動脈粥樣硬化，干預(yù)AGE-RAGE-氧化應(yīng)激軸，是治療糖尿病血管并發(fā)癥的新策略。

研究表明，血管緊張素Ⅱ通過增強(qiáng)NADPH氧化酶的活性而增加活性氧的產(chǎn)生［9］，血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑可下調(diào)NADPH氧化酶表達(dá)的作用，在減輕氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用［1］。我們的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AGE可上調(diào)RAGE的表達(dá)，且呈劑量相關(guān)性，坎地沙坦可以抑制該效應(yīng)［10］，本研究發(fā)現(xiàn)坎地沙坦預(yù)處理可起到抑制AGE所致NADPH氧化酶亞基p22phox上調(diào)作用，且抑制活性氧的表達(dá)，提示該效應(yīng)可能為坎地沙坦抑制RAGE的表達(dá)，從而抑制AGE-RAGE的相互作用，影響NADPH氧化酶p22phox亞基的表達(dá)及活性氧的表達(dá)。

總之，本研究揭示AGE可使血管外膜成纖維細(xì)胞的NADPH氧化酶p22phox亞基表達(dá)上調(diào)，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。坎地沙坦可干預(yù)該作用，從而減弱氧化應(yīng)激，推測可能對改善糖尿病患者血管重塑、減輕血管炎癥有一定的作用，抗氧化治療是糖尿病患者預(yù)防和治療動脈粥樣硬化可選擇的靶點(diǎn)。

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(助理編輯:曹洪紅)

Effect of Advanced Glycation End Products on NADPH Oxidase Subunit p22phox Expression and Reactive Oxygen Species Production in Vascular Adventitial Fibroblasts in Rats

LIU Ya-yang，LIHe，WU Zong-gui，TANG Xi-you.
Department of Cardiology，The 73071 Hospital of Chinese PLA，Xinyi(221400)，Jiangsu，China Corresponding Author:LIU Ya-yang，Email:liuyayang@gmail.com

Advanced glycation end-products;Receptor for advanced glycation end products(RAGE);Vascular adventitial fibroblasts;Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)oxidase;Subunit p22phox.

221400 江蘇省新沂市，中國人民解放軍73071部隊醫(yī)院 心內(nèi)科(劉亞洋)，江蘇省淮安市中醫(yī)院(李鶴)，上海第二軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心內(nèi)科(吳宗貴)，中國人民解放軍第八二醫(yī)院 心內(nèi)科(湯錫友)

劉亞洋 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病防治研究 Email:liuyayang@gmail.com 通訊作者:劉亞洋

R541

A

1000-3614(2012)03-0228-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2012.03.021Abstract

2011-06-30)

·難忘病例·