黃芩苷逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞耐藥株Bel-7402/ADM多藥耐藥性的相關(guān)機制研究

王術(shù)華

黃芩苷逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞耐藥株Bel-7402/ADM多藥耐藥性的相關(guān)機制研究

王術(shù)華

目的考察黃芩苷對人肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)機制。方法MTT法考察Baicalin對人肝癌多藥耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果 Baicalin逆轉(zhuǎn)Bel-7402/ADM多藥耐藥性的機制可能與抑制MDR1部分基因產(chǎn)物P-gp、MRP、GSH/GST的表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。結(jié)論Baicalin可能通過抑制MDR1部分基因產(chǎn)物P-gp、MRP、GSH/GST的表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)Bel-7402/ADM的多藥耐藥性。

黃芩苷;Bel-7402;多藥耐藥;逆轉(zhuǎn)

腫瘤治療由于長期使用化療藥物使患者的癌細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐受性即多藥耐藥性(MDR)。MDR的發(fā)生通常是由多種機制共同作用，如P-gp的外排泵機制［1-3］、GST的改變［4］等。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 黃芩苷(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院);鹽酸阿霉素(ADM)(浙江海正藥業(yè)股份有限公司);絲裂霉素(MMC)(協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社);Bel-7402、Bel-7402/AMD(購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所);CO2培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);MTT、P-gp單抗、單抗羊抗鼠熒光標(biāo)記杭體(美國Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞Bel-7402培養(yǎng)于含10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，肝癌耐藥細(xì)胞株BEL7402/ADM培養(yǎng)于含10%小牛血清及0.3μg/m l的阿霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，實驗一周前于無阿霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3 MTT法考察Baicalin對人肝癌多藥耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用 細(xì)胞以1×106L的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，孵育24h后，加入不同濃度的 ADM、MMC、DDP及Baicalin，繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后加入 MTT液，培養(yǎng)5h后，加入10%SDS，37℃過夜，用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD值)。

1.4 流式細(xì)胞儀測定P-gp、MRP蛋白、GSH/GST表達(dá) 將未經(jīng)Baicalin處理和經(jīng)過Baicalin處理過的BEL-7402/ADM細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度大于1×106個/ml)，PBS清洗兩遍，隨后分別加入P-gp、MRP、GSH/GST鼠抗人單克隆抗體，以鼠抗人isotype-matched單克隆抗體為內(nèi)對照，4℃孵育1h后，再分別加入羊抗鼠熒光標(biāo)記抗體。再于4℃下孵育30min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對熒光度進(jìn)行測定。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 每組收集5×105個細(xì)胞，用PBS溶液(含2%牛血清白蛋白)洗滌2次，分別加入FITC標(biāo)記的AnnexinV和PI，避光放置1h后，流式細(xì)胞儀檢測，每次讀取10000個細(xì)胞，通過Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。凋亡率(%)=(AnnexinV+PI+細(xì)胞數(shù)+AnnexinV+PI-細(xì)胞數(shù))/100。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對于Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用表1中AMD、MMC、VCR對Bel-7402/AMD的IC50均顯著低于Bel-7402/ADM經(jīng)Baicalin處理的 IC50，可見Baicalin對Bel-7402/ADM的多藥耐藥性具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。

表1 黃芩苷對Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用結(jié)果(±s，n=3)

表1 黃芩苷對Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用結(jié)果(±s，n=3)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

藥物IC50/μmol/L Bel-7402/ADM Bel-7402 Bel-7402/ADM-Baicalin(100μmol/L)Bel-7402/ADM-Baicalin(200μmol/L)Bel-7402/ADM-Baicalin(300μmol/L)AMD 30.32±1.65 0.35±0.03 18.63±1.92 12.43±1.02* 4.79±0.42＊＊MMC 35.64±1.96 1.12±0.05 23.58±1.34 16.43±1.29* 6.82±0.38＊＊VCR 18.26±1.29 0.11±0.02 15.36±1.91 8.31±0.64* 7.65±0.66＊＊

2.2 流式細(xì)胞儀檢測Baicalin對Bel-7402/ADM中MDR1基因部分表達(dá)產(chǎn)物的影響 Bel-7402/ADM經(jīng)Baicalin處理后，MDR1基因的表達(dá)產(chǎn)物P-gp、MRP、GSH/GST的表達(dá)均受到抑制，結(jié)果表明Baicalin逆轉(zhuǎn)Bel-7402/ADM多藥耐藥性的機制可能與抑制MDR1部分基因產(chǎn)物P-gp、MRP、GSH/GST的表達(dá)有關(guān)。

表2 流式細(xì)胞儀測定P-gp、MRP、GSH/GST熒光細(xì)胞的染色率

2.3 流式細(xì)胞儀檢測Baicalin對Bel-7402/ADM細(xì)胞凋亡的影響 圖1結(jié)果顯示，經(jīng)Baicalin處理過的Bel-7402/ADM細(xì)胞對AMD的敏感性顯著提高，其細(xì)胞凋亡率最高。結(jié)果表明，Baicalin對Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

圖1 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率

3 小結(jié)

本文通過考察黃芩苷對Bel-7402/AMD的多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)情況研究，可知黃芩苷可以逆轉(zhuǎn)Bel-7402/AMD的多藥耐藥性其作用機制可能與MDR1部分基因產(chǎn)物的過度表達(dá)有關(guān)，競爭性的飽和細(xì)胞膜表面的P-gp通道可能是黃芩苷抑制P-gp的主要作用機制。

［1］ 李睿，徐海帆．多藥耐藥蛋白P-糖蛋白的研究進(jìn)展．中國實用醫(yī)藥，2009，4(2):240．

［2］ 立彥，王自正．P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)研究進(jìn)展．放射免疫學(xué)雜志，2005，18(2):133．

［3］ 陳永剛，汪選斌．川芎嗪逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展．中國藥房，2009，20(21):1675-1676．

［4］ 李映良，金先慶．谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與腫瘤多藥耐藥．兒科藥學(xué)雜志，2007，13(4):73-76．

Themultidrug-resistantmechanism study of reverse effect of Baicalin for hepatocellular carcinoma cell

line(Bel7402/ADM)

WANG Shu-hua．Panjin College of Vocational and Technical，Panjin 124010，China

ObjectiveTo study themechanism that Baicalin reverse MDR of Bel-7402.M ethods U-sing MTTmethord，analyse reverse effect of Baicalin on MDR of Bel-7402.Results Themechanism which Baicalin reversed the multidrug resistance of Bel-7402/ADM may be associated with inhibition part of the gene product of MDR1，such as P-gp，MRP and GSH/GST over-expression and induction of apoptosis．Conclusion

Baicalin may reverse Bel-7402/ADM in multidrug resistance by inhibiting over-expression of part of the gene product in MDR1(P-gp、MRP and GSH/GST)and induced cells apoptosis．

Baicalin;Bel-7402;MDR;Reverse

124010盤錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院