乳酸菌在體外模擬胃腸環(huán)境中的抗性研究及其發(fā)酵特性

程秀芳，王叢叢，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

益生菌對(duì)健康的有益作用最早是由俄國(guó)科學(xué)家Metchnikoff提出的，他認(rèn)為腸道乳酸菌能夠通過(guò)防止腐敗菌的生長(zhǎng)而起到延長(zhǎng)壽命的作用.益生菌是指具有生物活性的，攝入適當(dāng)量時(shí)可以對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的微生物［1］.近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到腸道菌群對(duì)人類健康的重要性，以及膳食成分對(duì)腸道菌群的有益調(diào)節(jié)作用.益生菌的保健功能逐漸被人們認(rèn)可，這些功能包括：調(diào)節(jié)腸道菌群，預(yù)防胃腸道感染、抗腫瘤［2］、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)以及降膽固醇［3］等方面.益生菌對(duì)人體健康的有益作用人所共知，但是益生菌在自然界中的存活率較低：在經(jīng)過(guò)消化道時(shí)，由于胃液和膽汁的作用，大多數(shù)益生菌的活性幾乎喪失殆盡，而只有活著的乳酸菌才能表現(xiàn)出很好的保健功能，因此，篩選優(yōu)良的能夠耐受人體胃腸環(huán)境的益生菌是技術(shù)人員研究的重點(diǎn).以前的研究表明，不是所有的乳酸菌都能耐受低pH和高濃度的膽鹽環(huán)境，僅有少數(shù)乳酸菌具有這種能力［4］.目前，很多國(guó)家正對(duì)乳酸菌的選育工作進(jìn)行深入研究，但在國(guó)內(nèi)報(bào)道的還較少.本課題旨在從公司研究院保存的8株乳酸菌菌株中篩選耐酸、耐膽鹽，并能夠耐受人工胃液和人工腸液的菌株，以給生產(chǎn)乳酸菌制品的生產(chǎn)廠家提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種 BL67、BLLP、BL71、BL55、BLL26、SH33、BJLY、BLR3（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存）.

1.2 試劑 豬膽鹽（生化試劑）、吐溫－80、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、醋酸鈉、檸檬酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（中國(guó)天津巴斯夫化工有限公司）.

1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 形態(tài)特征及生理、生化特性鑒定 將8株菌分別在MRS培養(yǎng)基斜面上活化2～3次，在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)劃2環(huán)接種于液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，鏡檢，并用酸度計(jì)分別測(cè)定pH值.形態(tài)特征鑒定見(jiàn)表1，pH值結(jié)果見(jiàn)表2.

1.4.2 耐酸試驗(yàn) 人體空腹胃液的pH值在0.9～1.5之間，飯后胃液的pH值在3.5以上，通過(guò)大量的試驗(yàn)證實(shí)，乳酸菌在飯后胃液pH3.5以上都能存活，因此本試驗(yàn)?zāi)退岬闹笜?biāo)定于1.5.又因?yàn)槭澄镞^(guò)胃的時(shí)間較短，一般是1～2 h［7～9］，在空腹胃液中能夠存活1h的，被認(rèn)為能夠耐受餐后胃液，因此本試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間為1h.

試驗(yàn)方法：用HCl將生理鹽水的pH值調(diào)為1.5，滅菌30min.將液體種子以1%（v／v）的接種量轉(zhuǎn)入其中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)1h，取樣，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，以液體種子作為對(duì)照，將活菌數(shù)取對(duì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3.

1.4.3 耐膽鹽試驗(yàn) 人體小腸中膽鹽的含量在0.03%～0.3%之間，故采用0.3%的膽鹽作為篩選耐受腸道內(nèi)膽鹽的指標(biāo)［5］，在培養(yǎng)基中添加豬膽鹽使其濃度為0.3%，滅菌30 min，將液體種子以2%（v／v）的接種量轉(zhuǎn)入其中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)3h，取樣，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，以液體種子作為對(duì)照，將活菌數(shù)取對(duì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5.

1.4.4 模擬人工胃液試驗(yàn) 人工胃液的配置依照《中國(guó)藥典》2010年版附錄［6］.液體種子以2%（v／v）的接種量接種于人工胃液中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)，分別在0.5h、1h、2h、3h取樣，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，以液體種子作為對(duì)照，將活菌數(shù)取對(duì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4.

1.4.5 模擬人工腸液試驗(yàn) 人工腸液配置依照《中國(guó)藥典》2010年版附錄［6］.液體種子以2%（v／v）的接種量接種于人工腸液中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)，分別在0h、2h、4h、6h、8h取樣，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，以液體種子作為對(duì)照，將活菌數(shù)取對(duì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6.

1.4.6 發(fā)酵特性研究 用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌株BLL26在脫脂乳中37℃培養(yǎng)48h過(guò)程中的活菌數(shù)，并測(cè)定pH值，結(jié)果見(jiàn)圖1.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征鑒定

表1 乳酸菌的形態(tài)學(xué)結(jié)果

續(xù)表1：

2.2 培養(yǎng)24h后發(fā)酵液的pH值

表2 培養(yǎng)24h后發(fā)酵液的pH值（lgCFU?mL－1）

由表2可以看出：以菌株BLL26發(fā)酵液的pH值最低為3.75，其次是sh33和BL71，pH值都在4以下，說(shuō)明這三株菌的產(chǎn)酸能力較強(qiáng).

2.3 耐酸試驗(yàn)

表3 耐酸試驗(yàn)結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表3可以看出：菌株BLL26的耐酸能力最強(qiáng)，在pH 1.5的酸性溶液中1h其存活率為5.38%（10－1.27），其次是菌株BLR3存活率為1.82%（10－1.74），其余幾株菌存活的較少，說(shuō)明在這兩株菌耐受酸的能力比較強(qiáng).

2.4 耐人工胃液試驗(yàn)

表4 耐受人工胃液試驗(yàn)結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表4可以看出：8株菌在人工胃液中只有菌株BLL26能夠耐受，3h后活菌數(shù)存活率為0.79‰（10－3.1），其余7株菌死亡率較高.30min后，菌株BLL26沒(méi)有死亡現(xiàn)象，菌株BLLP、BL71的存活率為0.23‰（10－3.63）、0.11‰（10－3.94），而B(niǎo)L67、BL55的存活率更低.3h后，菌株BLL26活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)為106，在空腹胃液pH值1.5 1h能夠存活，因此在餐后胃液pH值3以上存活率會(huì)更高.以上結(jié)果說(shuō)明，菌株BLL26能夠耐受胃酸的能力較強(qiáng).

2.5 耐膽鹽試驗(yàn)

表5 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表5可以看出：菌株BLL26、菌株BL71在膽鹽溶液中培養(yǎng)3h后，活菌數(shù)存活率較高，分別是58.9%（10－0.23）、43.7%（10－0.36），說(shuō)明這兩株菌耐膽鹽能力較強(qiáng)；而菌株BJLY、SH33在膽鹽溶液中活菌數(shù)存活的較少，分別是0.24‰（10－3.72）和0.47‰，這兩株菌耐膽鹽能力較弱.

2.6 耐人工腸液試驗(yàn)

表6 耐受人工腸液試驗(yàn)結(jié)果（lgCFU?mL－1）

由表6可以看出：8株菌在人工腸液中6h存活率都很高，其中菌株BL71、BLL26、BL67、BLLP四株菌比0h的活菌數(shù)增加，說(shuō)明這四株菌能夠在腸液中存活并生長(zhǎng)，BL55、BJLY、SH33、BLR3四株菌活菌數(shù)下降，其中以BLR3活菌數(shù)下降的最多.

2.7 菌株BLL26在脫脂乳中37℃培養(yǎng)48h過(guò)程中的pH值和活菌數(shù)對(duì)數(shù)值的變化 由圖1可以看出：菌株BLL26在0～2h生長(zhǎng)比較緩慢，活菌數(shù)增長(zhǎng)較慢，為延緩期，2～6h活菌數(shù)增長(zhǎng)最快，活菌數(shù)的對(duì)數(shù)基本呈直線，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在12h活菌數(shù)達(dá)到最高，為穩(wěn)定期，直至48h活菌數(shù)并未減少，可能因?yàn)榫闎LL26能夠耐酸，活菌數(shù)目受pH值影響較小.pH值在2～12h迅速下降，12h后pH值下降比較平緩，48hpH值下降為3.3，說(shuō)明此株菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，使發(fā)酵液的pH值較低.由此看出此菌株發(fā)酵對(duì)數(shù)期較短，適宜酸乳的工業(yè)化發(fā)酵.

圖1 菌株BLL26在脫脂乳中培養(yǎng)48hpH值和活菌數(shù)對(duì)數(shù)值的變化曲線

3 討論

通過(guò)8株乳酸菌的耐酸、耐膽鹽能力比較，可知菌株BLL26能夠耐酸和耐膽鹽，并且菌株BLL26在人工胃液中3 h數(shù)量級(jí)為106，在人工腸液中6h數(shù)量級(jí)為109，能夠存活，說(shuō)明菌株BLL26能夠耐受人體胃腸道環(huán)境.通過(guò)其生長(zhǎng)曲線的研究表明，此菌株生長(zhǎng)周期較短，是一株很好的生產(chǎn)酸乳的菌株.而至于此菌株的其他特性，如抑菌性、耐藥性以及其他功能等還要進(jìn)一步進(jìn)行研究.

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