淫羊藿苷對D-半乳糖致衰老大鼠睪丸組織MMP-2及MMP-9表達的影響

謝高宇 陳 凱 劉浩然 齊敏友 張作濤 (貴陽中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州 貴陽 55000)

淫羊藿苷對D-半乳糖致衰老大鼠睪丸組織MMP-2及MMP-9表達的影響

謝高宇 陳 凱1劉浩然2齊敏友1張作濤 (貴陽中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002)

目的 觀察淫羊藿苷對衰老大鼠睪丸組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的影響。方法 SD大鼠30只，隨機均分為正常組、模型組、淫羊藿苷(80 mg/kg)組。大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg－1·d－1)造成大鼠亞急性衰老模型，同時灌胃給予藥物組，每天1次，連續(xù)給藥8 w。取出各組動物睪丸組織，測血清睪酮含量;取睪丸組織進行病理組織學觀察;RT-PCR方法檢測MMP-2及MMP-9mRNA表達，免疫組化方法檢測睪丸組織MMP-2及MMP-9表達。結(jié)果 與正常組比較，模型組血清睪酮水平下降;病理學檢測可見生精上皮層變薄，各級生精細胞減少;MMP-2、MMP-9 mRNA與蛋白表達降低。淫羊藿苷組明顯改善上述指標(P＜0.01或P＜0.05)。結(jié)論 淫羊藿苷對D-半乳糖所致的衰老大鼠睪丸損傷有明顯的保護作用，其機制可能與上調(diào)MMP-2、MMP-9水平有關(guān)。

淫羊藿苷;D-半乳糖;睪丸;基質(zhì)金屬蛋白酶

近年研究表明人體衰老與性腺功能和結(jié)構(gòu)的退化密切相關(guān)〔1〕。人體衰老時睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性病變，如睪丸重量減輕，生精細胞散在分布，支持細胞稀少，精子數(shù)目遞減，血清睪酮水平下降〔2〕。淫羊藿是一種傳統(tǒng)的補益中藥，具有補腎陽、強勁骨、祛風濕等多種功效〔3〕。其主要有效成分是淫羊藿苷，屬黃酮類化合物，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、延緩性腺衰老的作用〔4〕。前期的研究表明淫羊藿苷對衰老小鼠睪丸具有明顯的促進睪酮釋放及抗氧化作用〔5〕，但是否能通過上調(diào)睪丸組織基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(ECM)降解和合成來保護睪丸尚無報道。本研究擬觀察淫羊藿苷對衰老大鼠睪丸組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-9表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性健康大鼠，體重180～200 g(浙江醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。合格證號:SCXK(浙)2008-0033。

1.2 藥物及試劑 淫羊藿苷，由西安小草植物科技有限公司提供，淡黃色粉末，純度98.25%(HPLC檢測);睪酮檢測試劑盒，由天津九鼎生物工程有限公司提供;兔抗大鼠 MMP-2、MMP-9抗體，武漢博士德公司提供。

1.3 主要儀器 紫外分光光度計、離心機(鞏義市英峪予華儀器廠);電子天平(型號104，Mettler-Toledo公司);恒溫水浴箱(型號WB22，德國)，石蠟切片機(日本日立公司);Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件。

1.4 方法 大鼠隨機分為3組:正常組、模型組、淫羊藿苷組。除正常組外，模型組和淫羊藿苷組連續(xù)8 w每天皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg)，正常組注射同體積生理鹽水。在以上處理的同時，淫羊藿苷組每天灌胃淫羊藿苷80 mg/kg，正常組和模型組每天灌胃給予同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般情況 觀察造模后各組大鼠體重、精神狀態(tài)、毛發(fā)等情況。

1.5.2 血清睪酮 將血標本離心10 min(2 000 r/min)，取血清，按試劑盒說明測睪酮。

1.5.3 病理組織學 取右側(cè)睪丸組織以10%中性甲醛固定，沿其長軸垂直于曲細精管走向剖開，經(jīng)石蠟包埋切片，HE染色，于光鏡下觀察。

1.5.4 免疫組織化學染色 取各組大鼠睪丸組織石蠟包埋，4μm切片，烤片2 h，常規(guī)脫蠟處理，3%H2O2處理清除內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復。正常山羊血清封閉后，分別滴加兔抗大鼠MMP-2、MMP-9多單克隆抗體(1∶50)4℃孵育過夜。滴加Envision工作液(武漢博士德公司，1∶50)室溫30 min。DAB顯色，鏡下控制顯色程度后水洗。蘇木素襯染，經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片。定量分析:在高倍顯微鏡下(×400)隨機選取精曲小管，用Image-Pro Plus5.0彩色病理圖像分析軟件進行分析。測定免疫組化陽性顆粒的平均光密度值，并計算8個視野吸光度的均值，對MMP-2、MMP-9表達行半定量分析。

1.5.5 RT-PCR檢測睪丸組織MMP-2、MMP-9 mRNA表達取睪丸組織100 mg，加液氮研碎后，按Trizol說明書進行總RNA提取。用各自引物(金思特科技有限公司)，引物序列:MMP-2正義鏈:5'-CCCAGAAAAGATTGACGC-3';反義鏈:5'-CGACAGCATCCAGGTTAT-3';擴增條件 94℃，40 s;60℃，40 s;72℃，60 s;33個循環(huán)。MMP-9正義鏈:5'-CGTGGCCTACGTGACCTATG-3';反義鏈:5'-GGATAGCTCGGTGGTGTCCT-3';擴增條件94℃，40 s;64℃，40 s;72℃，60 s;36個循環(huán)。GAPDH正義鏈:5'-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3';反義鏈:5'-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3';擴增條件 94℃，40 s;56℃，40 s;72℃，60 s;30個循環(huán)。以GAPDH基因為內(nèi)參照，分別進行MMP-2、MMP-9的RT-PCR擴增。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察并用Image Master軟件分析條帶光密度值，分別計算MMP-2、MMP-9與GAPDH光密度值比值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組大鼠與正常組比較，體重明顯減輕，精神差，毛發(fā)脫落。淫羊藿苷組較模型組體重增加，精神狀態(tài)好，毛發(fā)光澤。見表1。

2.2 對大鼠血清中睪酮的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清睪酮水平明顯下降(P＜0.01)，而淫羊藿苷可顯著提高血清中睪酮活性(P＜0.01)。見表1。

表1 對D-半乳糖衰老大鼠體重及睪酮水平的影響(±s，n=8)

表1 對D-半乳糖衰老大鼠體重及睪酮水平的影響(±s，n=8)

與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，下表同

組別 體重(g) 睪酮(nmol/L)311.5±18.1 11.85±0.83模型組 256.6±8.11) 7.6±0.591)淫羊藿苷組 281.9±10.62) 9.75±0.642)正常組

2.3 對睪丸病理改變的影響 睪丸組織HE染色，于光鏡下觀察。結(jié)果表明:正常組小鼠睪丸支持細胞與各級生精細胞正常，管腔中精子可見;模型組睪丸各級生精細胞顯著減少，支持細胞少，細胞排列紊亂，精子數(shù)量大量減少。淫羊藿苷組生精細胞相對模型組增多，排列較為整齊，管腔中可見精子，與正常組較為接近。

2.4 睪丸組織中MMP-2及MMP-9的表達 免疫組化結(jié)果顯示，正常組MMP-2和MMP-9蛋白陽性表達主要見于圓形精子細胞以及支持細胞的胞質(zhì)。與正常組比較，模型組表達顯著減少，淫羊藿苷組的表達與模型組比較明顯降低。見表2。

表2 睪丸組織中MMP-2及MMP-9的表達(±s，n=4)

表2 睪丸組織中MMP-2及MMP-9的表達(±s，n=4)

組別0.292±0.056 0.321±0.052模型組 0.158±0.0391) 0.166±0.0411)淫羊藿苷組 0.241±0.0422) 0.292±0.0542)MMP-2 MMP-9正常組

2.5 睪丸組織中MMP-2及MMP-9 mRNA的表達 與正常組相比，模型組MMP-2及MMP-9 mRNA表達均顯著下降(P＜0.01);淫羊藿苷組可顯著升高模型組MMP-2及MMP-9 mRNA表達(P＜0.05或P＜0.01)。見圖1、表3。

圖1 睪丸組織中MMP-2、MMP-9 m RNA的表達

表3 睪丸組織中MMP-2及MMP-9 mRNA表達(±s，n=4)

表3 睪丸組織中MMP-2及MMP-9 mRNA表達(±s，n=4)

組別1.12±0.10 1.62±0.18模型組 0.73±0.151) 1.01±0.271)淫羊藿苷組 1.07±0.152) 1.32±0.142)MMP-2 MMP-9正常組

3 討論

D-半乳糖所致衰老動物模型是目前應(yīng)用最多的衰老模型之一，其所致模型穩(wěn)定可靠，造模方法簡易，在抗衰老藥物研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖可導致大鼠血清睪酮降低及睪丸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本實驗采用此法建立大鼠衰老模型。造模后衰老模型組大鼠體重明顯下降、精神差，可見明顯毛發(fā)脫落，血清睪酮含量的明顯下降，且睪丸組織形態(tài)學改變證實該模型建造成功。

MMPs與ECM之間的失衡可能是導致睪丸內(nèi)部微環(huán)境改變，從而導致睪丸病變的重要機制之一。MMP-2、MMP-9是MMPs家族中降解基底膜最重要的蛋白酶，由多種細胞以酶原形式在細胞內(nèi)合成從而分泌到細胞外，并在多種因素的調(diào)控下作用與ECM而發(fā)揮酶解效應(yīng)〔7〕。在睪丸中，ECM主要集中與曲細精管外周界膜上。MMP-2和MMP-9作為調(diào)節(jié)ECM平衡的主要因素之一，與此界膜關(guān)系密切〔8〕。本研究提示淫羊藿苷最終通過上調(diào)MMP-2與MMP-9途徑發(fā)揮其睪丸保護作用，但其作用機制尚有待進一步研究。

1 黃和賢，曹文富，彭 爽，等.延衰合劑對D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠睪丸及血清睪酮的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(12):2239-42.

2 Ponholzer A，Plas E，Schatzl G，et al.Association of DHEA-S and estradiol serum levels to symptoms of agingmen〔J〕.Aging Male，2002;5(4):233-8.

3 章振保，田生平，楊鏡秋，等.淫羊霍苷與睪酮治療亞急性衰老雄性大鼠的實驗研究〔J〕.中國男科學雜志，2006;20(8):13-8.

4 李秀英，徐曉玉.淫羊藿苷的藥理作用研究進展〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2007;28(6):45-6.

5 陳 凱，劉浩然，蘇燕慧，等.淫羊藿苷對D-半乳糖致衰老模型小鼠睪丸病變的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(10):1816-8.

6 朱亞珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法〔J〕.復旦學報(醫(yī)學版)，2007;34(4):617-9.

7 譚善峰，郭豐富，顧潤國.MMP-2、MMP-9及TIMP-1在人睪丸精原細胞瘤組織中的表達及意義〔J〕.山東醫(yī)學高等?？茖W校學報，2006;28(6):401-4.

8 Longin J，Le Magueresse-Battistoni B.Evidence thatMMP-2 and TIMP-2 are at play in the FSH-induced changes in Sertoli cells〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2002;189(2):25-6.

Effect of Icaririn on expression of MMP-2and MMP-9of testis tissue in D-galactose-induced aging rats

XIE Gao-Yu，CHEN Kai，LIU Hao-Ran，et al.
Pharmacology College of Guiyang College of Traditional Chinese M edicine，Guiyang 550002，Guizhou，China

Objective To investigate the effect of Icaririn on expression of MMP-2 and MMP-9 of testis tissue in D-galactose-induced aging rats.M ethods 30 SD ratswere random ly divided into three groups:normal，modeland Icaririn group(80mg/kg).The subacute agingmodel of ratswere induced by D-galacotose(200 mg·kg－1·d－1)following s.c.administration，at the same time，Icaririn was given i.g.for8 weeks.Testes ofeach group were removed from the scrotum.Serum level of testosteronewasmeasured respectively.Testicular tissuemorphology was observed by lightmicroscopy.The expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in testis tissue were examined using RT-PCRmethod.The expressions of MMP-2 and MMP-9 antibodies were also immunohistochemically investigated.Results Compared to the control group，the level of serum testosterone in testis was decreased in model group.The histopathological examination suggested that seminiferous tubule diameters and various grade of spermatocytes in the testismarkedly shrunk.Compared with controlgroup，the expressions of MMP-2 mRNA，MMP-2 protein and MMP-9 mRNA，MMP-9 protein were significantly increased in model group.These alterations were significantly attenuated in Icariin group(P＜0.01).Conclusions Icariin can evidently relieve testicular damage in D-galactose-induced aging rats，whichmight be related to improve the expressions of MMP-2 and MMP-9.

Icariin;D-galactose;Testis;Matrixmetalloproteinase

Q285

A

1005-9202(2012)16-3458-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.051

貴州省科技廳(黔科合中藥〔2011〕LKZ7032號)

1 浙江工業(yè)大學 2 湖南大學化學化工學院

張作濤(1953-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

謝高宇(1970-)，男，講師，主要從事病理組織學研究。

book=2,ebook=4134

〔2011-10-26收稿 2011-12-31修回〕

(編輯 曹夢園)