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    轉(zhuǎn)座子PiggyBac在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用

    2012-02-01 09:28:00馬元武張連峰
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)座子基因治療哺乳動(dòng)物

    馬元武,張連峰

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

    轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子是指宿主基因組內(nèi)發(fā)生基因座位置的改變的遺傳元件。當(dāng)對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行基因工程改造,使之?dāng)y帶一段外源基因,當(dāng)在轉(zhuǎn)座過程中插入基因的內(nèi)部或是鄰近位置,會(huì)對(duì)被插入基因造成基因功能的突變或失活,用以研究基因的功能[1]。轉(zhuǎn)座子一般由轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座酶所識(shí)別一段DNA序列 (轉(zhuǎn)座識(shí)別序列)所組成,轉(zhuǎn)座序列能夠在轉(zhuǎn)座酶的作用下完成轉(zhuǎn)座反應(yīng)。按轉(zhuǎn)座過程是否經(jīng)過RNA中間體而分為I型轉(zhuǎn)座子和II型轉(zhuǎn)座子。I型轉(zhuǎn)座子(或稱逆轉(zhuǎn)座子),需要先被轉(zhuǎn)錄成RNA,然后在由轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄成DNA插入宿主基因組內(nèi)。II型轉(zhuǎn)座子 (或稱為DNA轉(zhuǎn)座子),II型轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過程中不經(jīng)過RNA中間體,在由轉(zhuǎn)座子編碼轉(zhuǎn)座酶的作用下,通過復(fù)制或直接剪切的方式將轉(zhuǎn)座子DNA轉(zhuǎn)座入宿主基因組內(nèi)(圖1)。

    基因工程手段對(duì)DNA轉(zhuǎn)座子進(jìn)行改造,將轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座識(shí)別序列和轉(zhuǎn)座酶相分離,并在轉(zhuǎn)座序列內(nèi)插入一段外源感興趣的基因,當(dāng)在有轉(zhuǎn)座酶存在的條件下識(shí)別兩端的轉(zhuǎn)座序列介導(dǎo)轉(zhuǎn)座反應(yīng)的發(fā)生,已 經(jīng) 應(yīng) 用 于 黑 腹 果 蠅 (Drosophila melanogaster),線蟲 (Caenorhabditis elegans)等多種模式生物的基因功能研究。雖然人類基因組內(nèi)存在著大量轉(zhuǎn)座序列(約45%)[2-3],但由于進(jìn)化過程中的累計(jì)突變?cè)斐善浠钚詥适?,因此,有活性的轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用一直受到限制。直到DNA轉(zhuǎn)座子Sleeping Beauty(SB)才使得DNA轉(zhuǎn)座子作為一種遺傳工程工具應(yīng)用于哺乳動(dòng)物基因功能的研究。SB來源于鮭魚 (salmanoid)基因組,是一種的Tc1/mariner樣轉(zhuǎn)座子,Zoltan Ivics等通過分子重建的方式使其重新獲得了活性,并能在人和小鼠細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座[4]。新型轉(zhuǎn)座子的逐漸被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中有活性的轉(zhuǎn)座子有:1) hAT樣轉(zhuǎn)座子;2)Tcl樣轉(zhuǎn)座子包括 Sleeping Beauty和Frog Prince;3)PiggyBac轉(zhuǎn)座子家族。這三類轉(zhuǎn)座子中,轉(zhuǎn)座活性最高的為 Sleeping Beauty和PiggyBac,對(duì)這兩種轉(zhuǎn)座子的特性和轉(zhuǎn)座活性比較[5],發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)蠖度尺蛾 (cabbage looper moth Trichoplusia ni)來源的轉(zhuǎn)座子 PiggyBac相對(duì)具有更高的轉(zhuǎn)座活性,轉(zhuǎn)座過程中更高的攜帶外源基因插入宿主基因組的能力,并能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)座子及所攜帶外源基因的完全轉(zhuǎn)座,不會(huì)在供體位置造成任何遺傳物質(zhì)的改變,這些特性使其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、癌基因發(fā)現(xiàn)、iPS研究及基因治療研究方面前景誘人。

    1 PiggyBac轉(zhuǎn)座子

    圖1 轉(zhuǎn)座的分子機(jī)制。DNA線性表示,RNA曲線表示Fig.1 Molecular mechanisms of transposition.DNA is represented by straight lines.RNA transcripts are wavy lines

    PiggyBac分離于甘藍(lán)蠖度尺蛾[6],最初能夠在果蠅、紅腋斑粉蝶 (red flour beetle Tribolium Castaneum)及昆蟲中轉(zhuǎn)座,明顯不同于其它已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子類型,命名PiggyBac轉(zhuǎn)座子家族,簡(jiǎn)稱PB[7-8].PB元件是2472bp的轉(zhuǎn)座子序列擁有13 bp的末端反向重復(fù)序列以及編碼594個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)座酶序列組成[9],識(shí)別TTAA序列采用剪切、黏貼的DNA轉(zhuǎn)座模式(類似于Sleeping Beauty(SB)轉(zhuǎn)座子)[10]。

    PiggyBac樣轉(zhuǎn)座元件 (PiggyBac-like elements,PLE)普遍存在多物種內(nèi),很少具有轉(zhuǎn)座活性以及完整的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu),目前成功分離出了如 PBGD(1,3,5)、AyPLE和 AaPLE等多種PLE[11]。經(jīng)過密碼子優(yōu)化過的mPB以及hyPB(mPB基礎(chǔ)上的進(jìn)一步優(yōu)化獲得具有更高的轉(zhuǎn)座活性),是目前發(fā)現(xiàn)的在哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)座活性最高的 DNA轉(zhuǎn)座子[5,12-13]。轉(zhuǎn)座識(shí)別序列和轉(zhuǎn)座酶的分離可以使得轉(zhuǎn)座子發(fā)展為二元系統(tǒng),見圖1 C。提高了轉(zhuǎn)座安全性、攜帶外源基因的能力并增強(qiáng)了可操作性。轉(zhuǎn)座反應(yīng)需要轉(zhuǎn)座子序列和轉(zhuǎn)座酶同時(shí)存在。當(dāng)對(duì)轉(zhuǎn)座識(shí)別序列內(nèi)部插入一段外源基因時(shí),可實(shí)現(xiàn)目的基因向宿主基因組的靶向運(yùn)輸[1]。PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)作為一種有效的基因工程操作工具由于具有的高容量[14]、無痕跡轉(zhuǎn)座[9,13],安全性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)應(yīng)用在大規(guī)模研究基因的插入突變及基因功能研究、癌基因/抑癌基因的發(fā)現(xiàn)、iPS研究以及基因治療研究方面。

    2 哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用

    在不影響轉(zhuǎn)座效率的情況下,PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可高效攜帶十幾kb外源DNA靶序列轉(zhuǎn)座,用于靶基因的轉(zhuǎn)基因研究[12]。此外,當(dāng)所攜帶的外源基因含有基因捕獲元件時(shí),PB在轉(zhuǎn)座過程中,可捕獲基因組內(nèi)基因造成基因的插入突變或失活,通過轉(zhuǎn)座子的末端重復(fù)序列可非常容易定位插入基因的位點(diǎn),用以研究基因組內(nèi)大規(guī)?;蚬δ?。由于轉(zhuǎn)座造成基因的插入失活,研究基因與生長(zhǎng),基因與發(fā)育,以及基因與基因之間協(xié)調(diào)作用關(guān)系[3,15]。生物體任何功能的行使并不是單個(gè)基因所能完成的,他需要多個(gè)基因的協(xié)同調(diào)節(jié)表達(dá)共同來實(shí)現(xiàn)。PB的高轉(zhuǎn)座效率可造成多個(gè)基因功能的喪失,可研究多基因與生長(zhǎng)、發(fā)育以及基因之間的關(guān)系[3,15]。

    2.1 基因突變

    傳統(tǒng)的基因突變方式主要是通過粒子射線、化學(xué)誘變劑以及病毒感染來實(shí)現(xiàn)的。雖然這些方法能夠有效的產(chǎn)生突變,獲得感興趣的表型變化,但是后續(xù)突變位點(diǎn)的確定卻是費(fèi)事耗力[16]。幾十年來,由于缺少有效插入突變工具,哺乳動(dòng)物基因組的大規(guī)模遺傳學(xué)分析受到了很大的限制[17]。

    近年來,DNA轉(zhuǎn)座子SB和PB的發(fā)現(xiàn)和功能重塑,能夠在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有效轉(zhuǎn)座,使得這一局面得以改變。DNA轉(zhuǎn)座子通常由末端重復(fù)序列以及位于中間的轉(zhuǎn)座酶基因構(gòu)成[1],轉(zhuǎn)座反應(yīng)需要轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列和轉(zhuǎn)座酶同時(shí)存在。轉(zhuǎn)座酶缺失的轉(zhuǎn)座元件在有轉(zhuǎn)座酶瞬時(shí)表達(dá)的情況下就能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座反應(yīng)。轉(zhuǎn)座序列和轉(zhuǎn)座酶可以分離的特性,可構(gòu)建轉(zhuǎn)座識(shí)別序列和轉(zhuǎn)座酶相分離的二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[15]。在轉(zhuǎn)座識(shí)別序列之間插入我們感興趣的基因 (如功能基因、基因捕獲組件等),當(dāng)在轉(zhuǎn)座酶存在下,可以有效的將外源基因運(yùn)輸進(jìn)入宿主基因組內(nèi)。當(dāng)外源基因?yàn)榛虿东@組件時(shí),可以在轉(zhuǎn)座進(jìn)入基因組時(shí)有效捕獲基因組內(nèi)基因,實(shí)現(xiàn)基因的插入突變或失活。只要存在轉(zhuǎn)座酶即可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座,不同于以往的基因打靶方式,這一方法可實(shí)現(xiàn)基因組的大規(guī)模基因功能遺傳學(xué)分析[18]。

    2.2 癌基因的發(fā)現(xiàn)

    癌變的發(fā)生是受到遺傳和環(huán)境等多種因素影響所致,體細(xì)胞基因的突變?cè)谀[瘤的發(fā)生和發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。在過去的幾十年里,已經(jīng)應(yīng)用插入突變的方式在小鼠,大鼠等動(dòng)物模型中簡(jiǎn)單進(jìn)行癌變的遺傳學(xué)分析[19]。然而癌變的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,正常細(xì)胞的癌變可能需要多種突變基因的逐漸積累才能完成。有效基因突變工具的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)于研究癌變發(fā)生的遺傳學(xué)因素具有重要的意義。PB轉(zhuǎn)座子是目前發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座活性最高的DNA轉(zhuǎn)座子,在轉(zhuǎn)座時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)座子序列的完全剪切和轉(zhuǎn)座,在供體位置處不留任何轉(zhuǎn)座痕跡,通過轉(zhuǎn)座子的末端重復(fù)序列,可以通過接頭連接的PCR非常方便的對(duì)轉(zhuǎn)座子在基因組中的插入位點(diǎn)進(jìn)行定位,基于這些特點(diǎn),使得PB作為一種非常有潛力的遺傳工程工具,可以應(yīng)用于哺乳動(dòng)物大規(guī)模篩選癌基因的研究[20],目前已經(jīng)構(gòu)建出多種用于癌基因發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)載體如 T2/Onc,T2/Onc2和T2/Onc3等[19,21],為癌基因的發(fā)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。通過對(duì)插入位點(diǎn)的確定,可以研究基因組特定位點(diǎn)與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系[22-23]。

    2.3 基因治療與iPS

    基因治療,要求目的基因能夠特異、有效的導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi),并長(zhǎng)時(shí)間表達(dá),產(chǎn)生盡量少的毒副作用。目前大部分基因治療都采用病毒載體。然而,病毒載體的構(gòu)建和準(zhǔn)備不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力同時(shí)也存在許多其它問題,如逆病毒載體 (retroviruses)能夠長(zhǎng)效的實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá),但由于偏向于插入常染色體的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和基因的內(nèi)含子內(nèi),容易造成基因的插入失活,易至癌變[24];腺病毒載體(adenoviruses)可以將DNA運(yùn)輸?shù)教幱诜至鸦蜢o止期的細(xì)胞內(nèi),由于不插入基因內(nèi)部,不造成致癌突變,但不能保證目的基因的長(zhǎng)效、穩(wěn)定表達(dá),且易引起宿主的免疫應(yīng)答[25];另一類為腺聯(lián)病毒載體(adeno-associated viruses),降低了宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)穩(wěn)定的表達(dá),但目的基因的大小卻受到限制[26]。新型的非病毒載體的應(yīng)用就顯得非常重要。

    SB和PB轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn),使得轉(zhuǎn)座子作為一種有用的基因工程工具應(yīng)用于哺乳動(dòng)物,SB和PB的“剪切-黏貼”的DNA轉(zhuǎn)座模式,相對(duì)低的費(fèi)用、低的免疫反應(yīng)性、高的轉(zhuǎn)座效率、高容量,安全性強(qiáng)等特點(diǎn)[27],使其在基因治療方面具有非常大的應(yīng)用潛力。自SB于1997年發(fā)現(xiàn)以來,人們一直致力于將其應(yīng)用于基因治療,并取得了許多可喜的成果,如可以用于小鼠遺傳缺陷造成的基因病的治療研究,如 I型酪氨酸血癥[28],A型[29]和 B型[30]血友病,亨廷頓?。?1]等遺傳型疾病的治療研究。隨著研究的不斷深入,通過對(duì) SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)引入嵌合體抗原受體來介導(dǎo)T細(xì)胞的重定向特異性,已經(jīng)用于 I/II期臨床試驗(yàn)[27]。然而,SB的相對(duì)較低的轉(zhuǎn)座活性,以及明顯的供體附近位置轉(zhuǎn)座偏好性,限制了其在基因治療方面的應(yīng)用。PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的高轉(zhuǎn)座活性和無痕跡轉(zhuǎn)座,使得PB成為一種比SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有更廣闊應(yīng)用前景的DNA轉(zhuǎn)座子[32-34]。

    SB和PB雖然在基因治療方面潛力巨大,但它們的安全性仍是基因治療的所考慮重點(diǎn),非特異性整合會(huì)導(dǎo)致所不期望的后果[35]。這一不足正在通過在轉(zhuǎn)座酶中嵌合入 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNA binding domain,DBD)進(jìn)行彌補(bǔ),前期的實(shí)驗(yàn)表明,這一改進(jìn)能有效提高轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座效率和特異性[36-38]。此外,只要有轉(zhuǎn)座酶的存在就會(huì)有轉(zhuǎn)座的發(fā)生,也使得轉(zhuǎn)座相對(duì)不穩(wěn)定,Johann Urschitz等通過對(duì)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn),獲得了一種不依賴于輔助載體的轉(zhuǎn)座系統(tǒng),轉(zhuǎn)座發(fā)生后會(huì)造成轉(zhuǎn)座酶的失活,解決這一問題[39]。

    iPS的顯著優(yōu)勢(shì)是具有類似于胚胎干細(xì)胞的多潛能性,并且可以用于誘導(dǎo)分化成為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層用以移植來治療退行性或遺傳性疾?。?0]。通常情況下,鼠或人的成纖維細(xì)胞的重新編程為多潛能干細(xì)胞,需要四種轉(zhuǎn)錄因子 c-Myc,Klf4,Oct4 and Sox2[41]的輔助.以往應(yīng)用于iPS研究輔助因子的運(yùn)輸工具主要為病毒載體,但是病毒載體存在著類似于基因治療方面的缺陷,很難排除由于外源基因?qū)牖蚪M所造成的改變對(duì) iPS的影響。

    PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在轉(zhuǎn)座后不留任何足跡,在由 PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)提供四種轉(zhuǎn)錄因子 c-Myc,K lf4,Oct4和Sox2完成 iPS后,可以通過提供 PB轉(zhuǎn)座酶在基因組內(nèi)消除載體。由于 PB的無痕跡轉(zhuǎn)座,不會(huì)造成遺傳物質(zhì)的改變,可以用于探索體細(xì)胞的重新編程時(shí),消除外源載體因素所可能造成的影響,為iPS的研究提供了有力的工具[39,42-43]。

    3 小結(jié)

    PB轉(zhuǎn)座子是目前在哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)座活性最高的轉(zhuǎn)座子,并且可以攜帶高達(dá)十幾Kb的外源基因轉(zhuǎn)座而不影響其效率,使其在哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因、癌基因的大規(guī)模篩選、基因治療方面具有巨大的應(yīng)用潛力。此外,PB的無痕跡轉(zhuǎn)座對(duì)產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因、無遺傳物質(zhì)改變的iPS研究也具有非常重要的意義和應(yīng)用前景。然而,轉(zhuǎn)座子的非特異性轉(zhuǎn)座,也影響了其在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用。因此,DNA轉(zhuǎn)座子雖然具有誘人的應(yīng)用前景,但應(yīng)用的道路卻很漫長(zhǎng)。

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