壯陽(yáng)藥效動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的改進(jìn)

曹 瑩，孔煥育，丘玉昌，王杞妹，崔東方，林繼紅

（1.南方醫(yī)科大學(xué)新藥評(píng)價(jià)中心，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515）

勃起功能障礙 （erectile dysfunction，ED）是指陰莖持續(xù)（至少6個(gè)月）不能達(dá)到和維持充分的勃起以獲得滿意的性生活［1］。在 40～70歲的男性中約有50％的男性有不同程度的ED，ED成為困擾男性的最常見(jiàn)病癥之一。近年來(lái)，有關(guān)ED的研究進(jìn)展十分迅速，基礎(chǔ)研究不斷深入，許多治療手段廣泛開(kāi)展，尤其是藥物治療的快速發(fā)展［2］。尋求一個(gè)簡(jiǎn)單有效的壯陽(yáng)藥效評(píng)價(jià)方法，對(duì)于篩選有效的治療藥物有很大的幫助?，F(xiàn)行采用的較為簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)方法主要是通過(guò)觀察記錄給藥前后動(dòng)物性行為活動(dòng)的改變，計(jì)算動(dòng)物陰莖勃起指數(shù)（penile erection index，PEI）并做出比較，從而對(duì)候選藥物的壯陽(yáng)藥效作出評(píng)價(jià)［3-5］。但這種方法在實(shí)際操作過(guò)程中也存在一定的缺陷，一方面，采用傳統(tǒng)的人工觀察需要耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間，而且會(huì)因?yàn)槿斯げ僮髂芰Φ挠邢扌院蛣?dòng)物行為活動(dòng)的的不可回放性造成部分?jǐn)?shù)據(jù)的丟失；另一方面，部分壯陽(yáng)藥在沒(méi)有性刺激的情況下并不能有效的改善ED，如經(jīng)典壯陽(yáng)藥西地那非，若在動(dòng)物性行為活動(dòng)的觀察期間不給予適宜的性刺激會(huì)有可能造成藥物篩選的假陰性。針對(duì)這些原因，本實(shí)驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)的壯陽(yáng)藥效評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了改良，采用攝像頭觀察動(dòng)物性行為活動(dòng)并在該過(guò)程中給予動(dòng)物適度的性刺激，并用經(jīng)典壯陽(yáng)藥西地那非驗(yàn)證該評(píng)價(jià)方法的效性。

1 材料和方法

1.1 材料

成年健康SD大鼠，雄性，80只（體重220±10 g），雌性，4只（體重200±10 g），由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK［粵］2006-025）。枸櫞酸西地那非片（輝瑞制藥有限公司），特制玻璃大鼠籠及鼠籠架。

1.2 方法

80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為8組（n=10）：對(duì)照A組、對(duì)照B組、對(duì)照C組、對(duì)照D組、模型A組、模型B組、模型 C組、模型 D組。每組10只，分別置于特制的玻璃鼠籠中，自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，開(kāi)始給藥，模型組大鼠均灌胃給予西地那非10 mg/kg，對(duì)照組大鼠給予相同容量的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃給藥14 d。每次給藥后連續(xù)記錄2 h內(nèi)動(dòng)物陰莖勃起、陰部理毛、爬背次數(shù)和每種性行為活動(dòng)參與的動(dòng)物數(shù)。

其中，對(duì)照A組及模型A組每次給藥后人為觀察大鼠性行為活動(dòng)（人為觀察組）；對(duì)照B組及模型B組每次給藥后于安靜無(wú)人環(huán)境下采用攝像頭觀察大鼠性行為活動(dòng)（攝像頭觀察組）；對(duì)照C組及模型C組每次給藥后將一只雌鼠于給藥后0～30 min及90～120 min置于各鼠籠籠蓋上對(duì)雄鼠進(jìn)行性誘導(dǎo)并于安靜無(wú)人環(huán)境下采用攝像頭觀察大鼠性行為活動(dòng)（雌鼠間斷誘導(dǎo)組）；對(duì)照D組及模型D組每次給藥后在觀察的全過(guò)程（0～120 m in）將一只雌鼠置于各鼠籠籠蓋上對(duì)雄鼠進(jìn)行性誘導(dǎo)并于安靜無(wú)人環(huán)境下采用攝像頭觀察大鼠性行為活動(dòng)（雌鼠持續(xù)誘導(dǎo)組）。

1.3 觀察指標(biāo)：給藥后2hPEI

記錄各組大鼠給藥2 h內(nèi)動(dòng)物陰莖勃起、陰部理毛、爬背次數(shù)和參與動(dòng)物數(shù)，計(jì)算 PEI值。（PEI =每組大鼠相關(guān)性行為反應(yīng)總次數(shù)×每組中有相關(guān)性行為反應(yīng)的大鼠數(shù)/每組大鼠數(shù)量）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后2h各組大鼠PEI值

與對(duì)照C組相比，模型C組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；與對(duì)照 D組相比，模型 D組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；與模型A組相比，模型B組、模型C組及模型D組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；與模型B組相比，模型C組及模型D組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；而模型D組與模型C組間大鼠給藥后2 h PEI值無(wú)顯著性差異。各組大鼠 PEI值見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠給藥后2h PEI值的比較Tab.1 Comparasion of 2h PEI after each drug adm inistration

2.2 模型C組及模型D組大鼠給藥后2h內(nèi)各時(shí)間段PEI值

模型C組與模型D組給藥后0～60 min時(shí)間段內(nèi)PEI值比較無(wú)顯著性差異；給藥后60～120 m in時(shí)間段內(nèi) PEI值比較有顯著性差異（P＜0.05），模型C組明顯高于模型D組（見(jiàn)表2）。

表2 大鼠給藥后各時(shí)間段 PEI值的比較Tab.2 Comparasion of PEI for each time interval

3 討論

目前公認(rèn)的勃起功能障礙的動(dòng)物模型有去勢(shì)建立腎虛模型、動(dòng)物交配能力模型、重復(fù)應(yīng)激性小鼠性行為低下模型、房勞過(guò)度致腎虛模型等［6］。這些模型雖在一定程度上模擬了勃起功能障礙的臨床表現(xiàn)，但操作較為繁瑣、觀察困難并涉及造模成功率的問(wèn)題，一定程度上影響壯陽(yáng)藥物篩選的進(jìn)度。本實(shí)驗(yàn)主要觀察給藥后動(dòng)物相關(guān)性行為活動(dòng)情況，通過(guò)優(yōu)化觀察過(guò)程中的一些影響因素，尋求一個(gè)簡(jiǎn)單有效的壯陽(yáng)藥效評(píng)價(jià)方法。

陰莖勃起的生理機(jī)制涉及性刺激過(guò)程中陰莖海綿體內(nèi)一氧化氮（NO）的釋放。NO激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）水平增高，使海綿體內(nèi)平滑肌松弛，血液充盈［7］。西地那非能夠通過(guò)抑制海綿體內(nèi)分解cGMP的5型磷酸二酯酶（PDE5）來(lái)增強(qiáng)NO的作用，對(duì)陰莖有很強(qiáng)的勃起作用［8］。西地那非由美國(guó)輝瑞公司研制生產(chǎn)，該藥于1998年4月在美國(guó)以商品名 Viagra（偉哥）上市，是目前臨床上用于治療勃起功能障礙最有效的藥物之一［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用西地那非作為陽(yáng)性藥物來(lái)評(píng)價(jià)壯陽(yáng)藥效評(píng)價(jià)方法是否可行。

西地那非作為PDE5抑制劑，能刺激使陰莖海綿體內(nèi)釋放NO，NO活化鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，并減少cGMP降解，增加海綿體動(dòng)脈的最大血流速度和平均血流速度，增加血流量，促使陰莖勃起。其對(duì)離體陰莖海綿體無(wú)直接舒張作用。當(dāng)性刺激引起局部NO釋放時(shí)，西地那非抑制PDE5可增加海綿體內(nèi)cGMP水平，海綿體內(nèi)平滑肌松弛，血液流入海綿體。在沒(méi)有性刺激時(shí)，推薦劑量的西地那非不起作用［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給予雌鼠誘導(dǎo)性刺激的情況下，大鼠出現(xiàn)較為頻繁的性行為活動(dòng)，給予西地那非的模型組大鼠更為明顯，同對(duì)應(yīng)的對(duì)照組大鼠PEI值相比有顯著性差異。在本實(shí)驗(yàn)中，采用了兩組雌鼠誘導(dǎo)方式，一組是于給藥后0～30 min及90～120 min時(shí)間段給予雌鼠誘導(dǎo)即間斷誘導(dǎo)，另一組置于觀察的全過(guò)程（0～120 min）給予雌鼠誘導(dǎo)即持續(xù)誘導(dǎo)。在給藥后2 h該兩組大鼠PEI值雖無(wú)明顯差異，但分兩個(gè)時(shí)間段（0～60 m in，60～120 min）比較，結(jié)果顯示，0～60 min時(shí)間段兩組大鼠PEI值相似，60～120 m in時(shí)間段間斷誘導(dǎo)組大鼠PEI值明顯高于持續(xù)誘導(dǎo)組。持續(xù)誘導(dǎo)方式在本實(shí)驗(yàn)中雖沒(méi)有造成最終的藥效評(píng)價(jià)結(jié)果的不同，但在今后的壯陽(yáng)藥物篩選過(guò)程中倘若改變數(shù)據(jù)采集的時(shí)間段會(huì)對(duì)藥效評(píng)價(jià)會(huì)造成一定的影響。因此，在誘導(dǎo)方式的選擇方面推薦采用間斷誘導(dǎo)方式。

此外，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，攝像頭觀察組PEI值明顯高于人為觀察組，差異有顯著性。究其原因，一方面由于鼠科動(dòng)物對(duì)外界刺激反應(yīng)敏感，噪聲能引起內(nèi)分泌功能紊亂和性功能減退。攝像頭觀察可弱化噪聲等外界環(huán)境因素的影響；另一方面，攝像頭觀察可錄制影音資料，影音資料可反復(fù)回放進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集可保證數(shù)據(jù)完整不缺失。

綜上所述，在壯陽(yáng)藥篩選中，可以選擇在安靜無(wú)人環(huán)境下、采用攝像頭觀察雄鼠性行為活動(dòng)并在部分時(shí)間段給予雌鼠間斷誘導(dǎo)性刺激，計(jì)算該過(guò)程PEI值評(píng)價(jià)候選藥物的壯陽(yáng)藥效。

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