運動聯(lián)合福善美對去卵巢大鼠骨密度和神經(jīng)傳導(dǎo)的影響*

鄺志強， 張榮華

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院1康復(fù)科，2中醫(yī)科，廣東廣州510632)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織的微細結(jié)構(gòu)破壞為特征，最終導(dǎo)致骨強度下降、骨脆性增高及骨折危險性增加的一種全身骨骼代謝障礙的疾病。骨痛和易骨折為其主要癥狀［1－3］，嚴重影響患者生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。人體骨骼每年約10%的骨量由骨形成(bone formation)和骨吸收(bone absorption)不斷偶聯(lián)更新，以維持骨質(zhì)量和適應(yīng)性的強度。絕經(jīng)后，機體卵巢功能低下，血清雌激素水平下降致骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨量的丟失和骨礦物質(zhì)含量變化，繼而形成骨質(zhì)疏松，稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)。PMOP患者的發(fā)病年齡在50～70歲之間，骨吸收與骨形成均活躍，但以骨吸收為主［4］，表現(xiàn)為骨量迅速丟失，易發(fā)生骨折，且骨折多發(fā)生在以骨松質(zhì)為主的椎體、股骨上端及橈骨遠端。據(jù)2000年統(tǒng)計資料顯示，全世界共有7.4億絕經(jīng)期婦女，骨質(zhì)疏松癥是其常見病之一［5］。因此，研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及其治療和防治仍然是醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題，具有重要的臨床意義。

福善美，又名阿侖膦酸鈉，是強效骨吸收抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床，用于預(yù)防和治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。運動增加肌肉對骨的牽拉，修復(fù)骨結(jié)構(gòu)和骨量，刺激成骨細胞(osteoblast，OB)的作用［6－7］。運動作為一種最經(jīng)濟和基本的有效方法，其與二膦酸鹽聯(lián)合運用在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效尚缺乏研究。本實驗通過大鼠卵巢切除來復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松這一經(jīng)典模型，研究運動和福善美聯(lián)合應(yīng)用對去卵巢切除大鼠骨密度、神經(jīng)傳導(dǎo)及骨代謝的影響，觀察運動是否可增強福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用及可能機制，為臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病人的治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 動物

6月齡雌性 SD 大鼠，體重為(248.2±12.0)g，購自廣東省動物中心，合格證號為SCXK(粵)2008－0002。實驗大鼠自由飲水進食，分籠飼養(yǎng)，實驗前置于環(huán)境中適應(yīng)3 d，相對濕度控制在60%～80%，溫度控制在(24±2)℃。大鼠處理符合暨南大學(xué)實驗動物管理的相關(guān)規(guī)定。

2 主要試劑、器材與儀器

2.1 主要試劑 阿侖膦酸鈉片，又名福善美(fosamax，F(xiàn)OX)，70 mg/粒，購自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院。大鼠血清雌二醇(estradiol，E2)、Ⅰ型前膠原羧基端前肽(type I procollagen carboxy－terminal propeptide，PICP)和Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)端肽(typeⅠcollagen carboxy－ terminal cross－ linked telopeptide，ICTP)ELISA檢測試劑盒購自R＆D。

2.2 器械 固定板、無菌洞巾、持針器、縫針、縫線、有(無)齒鑷、直(彎)剪、眼科剪、眼科鑷、輸液裝置、注射器、手術(shù)刀、刀片等均由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。

2.3 主要儀器 Model 550型酶標(biāo)儀(Bio－Rad);雙能X線骨密度儀(Lunar，Prodigy型);肌電圖儀(Dantec)。

3 方法

3.1 實驗分組及模型建立 90只6月齡雌性 SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組(sham)18只和去卵巢模型組(ovariectomized rats，OVX)72只。去卵巢模型組大鼠腹腔注射0.2%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)全身麻醉，仰臥位固定，備皮、消毒，無菌操作行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，假手術(shù)組除不切除卵巢外，其余操作均與去卵巢模型組操相同。術(shù)后8周，雙能X線骨密度儀在第4腰椎測量假手術(shù)組和去卵巢模型組大鼠骨密度(bone mineral density，BMD)并記錄(BMD8w)。尾靜脈采血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，ELISA檢測血清E2含量(ng/L)。將存活去卵巢模型組大鼠分為4組:模型組(OVX)、福善美治療組(OVX+FOX)、運動治療組(OVX+EX)和福善美與運動聯(lián)合治療組(OVX+FOX+EX)，分別給予1 mg·kg－1·d－1福善美灌胃和(或)跑臺運動干預(yù)治療12周。

3.2 大鼠骨密度檢測 各組大鼠干預(yù)治療12周后，0.2%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，雙能X線骨密度儀在第4腰椎測量各組大鼠BMD并記錄(BMD20w)。

3.3 大鼠左側(cè)股神經(jīng)傳導(dǎo)速度、運動末端潛伏期、復(fù)合肌肉動作電位檢測 各組大鼠干預(yù)治療12周后用肌電圖機檢測大鼠左側(cè)股神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MCV，m/s)、運動末端潛伏期(motor distal latency，ML，ms)和復(fù)合肌肉動作電位(compound muscle action potential，CMAP，mV)。

3.4 ELISA檢測大鼠血清骨代謝指標(biāo)變化 去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠干預(yù)治療12周后，腹腔注射0.2%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)麻醉，仰臥位固定，胸部正中切口開胸暴露心臟，心臟采血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，－80℃保存?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒操作說明測定血清PICP、ICTP含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準誤(±sE)表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，各組方差齊時，采用LSD法進行兩兩比較;各組方差不齊時，用Tamhane's T2法兩兩比較。2×2析因設(shè)計的方差分析檢測各處理組間有無交互作用。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠卵巢切除8周后血清雌二醇及骨密度的變化

大鼠卵巢切除8周后，模型組血清雌二醇含量為(9.27 ±0.70)ng/L，較假手術(shù)組(42.47 ±0.51)ng/L明顯降低(P＜0.05)，見表1;模型組 BMD為(0.252 ±0.002)g/cm2，與假手術(shù)組相比明顯降低(P＜0.05)，見表1。

表1 大鼠卵巢切除后8周血清雌二醇及骨密度水平變化Table 1.Changes of serum estradiol(E2)and bone mineral density(BMD)of lumbar vertebra 8 weeks after the ovariectomy of rats(±sE)

表1 大鼠卵巢切除后8周血清雌二醇及骨密度水平變化Table 1.Changes of serum estradiol(E2)and bone mineral density(BMD)of lumbar vertebra 8 weeks after the ovariectomy of rats(±sE)

▲P ＜0.05 vs sham group.

Group n E2(ng/L) BMD(g/cm2)Sham 18 42.47 ±0.51 0.304 ±0.006 OVX 64 9.27 ±0.70▲ 0.252 ±0.002▲

2 各組大鼠卵巢切除干預(yù)治療12周后骨密度的變化

如圖1所示，大鼠卵巢切除干預(yù)治療12周后，各組大鼠第4腰椎骨密度與假手術(shù)組相比顯著降低(P＜0.05)，福善美、運動及運動聯(lián)合福善美均可明顯增加其骨密度(P＜0.05)，且聯(lián)用效果較福善美、運動單用顯著，但兩單用組之間未見明顯差別(P＞0.05)。2×2析因設(shè)計的方差分析顯示，福善美與運動2種處理方式之間不存在交互作用(P＞0.05)，即福善美與運動在治療骨質(zhì)疏松大鼠時單獨發(fā)揮作用，見表2。

Figure 1.Changes of BMD of Lumbar verterbra.±sE.n=14～18，▲P ＜ 0.05 vs sham group;*P ＜ 0.05 vs OVX group;△P ＜0.05 vs OVX+FOX+EX group.圖1 大鼠卵巢切除干預(yù)治療12周后各組骨密度變化

3 運動和(或)福善美對骨質(zhì)疏松大鼠左側(cè)股神經(jīng)傳導(dǎo)的影響

如表3所示，卵巢切除骨質(zhì)疏松大鼠干預(yù)治療12周后，各組間左側(cè)股神經(jīng)MCV和CMAP未見明顯改變(P＞0.05)。模型組與假手術(shù)組相比，左側(cè)股神經(jīng)ML未見明顯差別(P＞0.05);福善美治療組與模型組相比，ML未見明顯改變(P＞0.05);運動單獨治療、運動與福善美聯(lián)合治療組與模型組相比，ML均明顯縮短(P＜0.05)，且聯(lián)合治療組較單純福善美治療組ML明顯減短(P＜0.05)，與單純運動治理組相比，未見顯著差異(P＞0.05)。2×2析因設(shè)計的方差分析顯示，福善美與運動2種處理方式之間不存在交互作用(P＞0.05)，見表2。

表2 2×2析因的方差分析顯示各指標(biāo)P值改變Table 2.The changes of P values of the indexes calculated by 2×2 analysis of variance of factorial design

表3 運動和(或)福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠左側(cè)股神經(jīng)傳導(dǎo)的影響Table 3.Effects of EX and/or FOX on MCV，ML and CMAP of the left femoral nerve(±sE)

表3 運動和(或)福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠左側(cè)股神經(jīng)傳導(dǎo)的影響Table 3.Effects of EX and/or FOX on MCV，ML and CMAP of the left femoral nerve(±sE)

*P ＜0.05 vs OVX group;△P ＜0.05 vs OVX+FOX+EX group.

Sham 18 40.72 ±0.87 7.48 ±0.29 12.51 ±0.43 OVX 14 38.53 ±0.55 8.94 ±0.45 11.50 ±0.43 OVX+FOX 15 39.47 ±1.36 8.49 ±0.73△ 11.73 ±0.96 OVX+EX 15 38.99 ±0.75 7.57 ±0.55* 12.66 ±0.41 OVX+FOX+EX 16 40.10 ±1.09 6.61 ±0.97*12.74 ±0.57

4 運動和(或)福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清Ⅰ型前膠原羧基端前肽的影響

去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠干預(yù)治療12周后模型組血清 PICP 含量為(85.39 ±0.29)μg/L，與假手術(shù)組［(76.33 ±0.64)μg/L］相比明顯升高(P ＜0.05)。福善美、運動、運動與福善美聯(lián)合可以顯著降低血清PICP含量(P＜0.05 vs OVX)。運動與福善美聯(lián)合治療組較福善美、運動單用治療組PICP含量顯著降低(P＜0.05);福善美治療組較運動治療組PICP含量低(P＜0.05)，見圖2。2×2析因設(shè)計的方差分析顯示，福善美與運動2種處理方式之間不存在交互作用(P ＞0.05)，見表2。

Figure 2.Effects of EX and/or FOX on serum type I procollagen carboxy－terminal propeptide after 12－week treatment in ovariectomized rats.±sE.n=14～18，▲P＜0.05 vs sham group;*P ＜0.05 vs OVX group;◆P ＜0.05 vs OVX+FOX group;△P ＜0.05 vs OVX+FOX+EX group.圖2 運動和(或)福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清型前膠原羧基端前肽的影響

5 運動和(或)福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)端肽的影響

如圖3所示，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠干預(yù)治療12周后，模型組大鼠血清ICTP含量顯著升高(P＜0.05 vs sham)。福善美、運動與福善美聯(lián)合均可顯著降低模型組血清ICTP含量(P＜0.05)。運動與福善美聯(lián)合治療組較運動單獨治療組ICTP含量降低明顯(P＜0.05)，與福善美單獨治療組相比，未見明顯差異(P＞0.05)。福善美與運動2個單獨治療組之間無明顯差異。2×2析因設(shè)計的方差分析顯示，福善美與運動2種處理方式之間不存在交互作用(P＞0.05)，見表 2。

Figure 3.Effects of EX and/or FOX on serum typeⅠcollagen carboxy－terminal cross－linked telopeptide after 12－week treatment in ovariectomized rats.±sE.n=14～18，▲P ＜0.05 vs sham group;*P ＜0.05 vs OVX group;△P ＜0.05 vs OVX+FOX+EX group.圖3 運動和(或)福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)端肽的影響

討 論

OP是一種全身性代謝障礙疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量和預(yù)期壽命［1－3］。雌激素對骨量維持至關(guān)重要，它既能通過對降鈣素、甲狀旁腺激素的影響而抑制骨鈣釋放;又可通過成骨細胞、破骨細胞上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)而影響骨量［8－9］。絕經(jīng)后由于卵巢功能低下，血清雌激素水平下降，繼而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，即PMOP。PMOP表現(xiàn)為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，即骨吸收與骨形成均活躍，但以骨吸收為主［4］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及其治療和防治的研究，仍然是醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題，具有重要的臨床意義。

二膦酸鹽(bisphosponates)是目前治療OP的最有效藥物之一，其作用于破骨細胞的骨吸收環(huán)節(jié)，用于預(yù)防和治療原發(fā)性和糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素及肝素等引起的繼發(fā)性O(shè)P［10］。在骨質(zhì)疏松的防治方法中，運動療法是一種最經(jīng)濟和基本的有效方法［10］。然而，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病人在服用二膦酸鹽治療的同時輔以運動，是否可增強單獨藥物治療對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的療效?尚缺乏研究。因此，本實驗通過大鼠卵巢切除來復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松這一經(jīng)典模型［11－12］，研究二膦酸鹽(福善美)和運動聯(lián)合運用對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用，觀察運動是否可增強福善美對骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用，為臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病人的治療提供理論依據(jù)。

BMD指單位面積所含的骨礦物量，它是反映人體骨骼代謝狀況的一項重要指標(biāo)［13］。骨密度是診斷OP的金標(biāo)準，也是估計骨質(zhì)疏松的程度、評價骨質(zhì)疏松療效的必要手段［13］，其高低取決于骨代謝的狀況。大鼠卵巢切除8周后，去卵巢模型組大鼠BMD較假手術(shù)組顯著降低，且血清雌二醇很低或者檢測不出來，這說明大鼠卵巢切除8周后骨質(zhì)疏松模型復(fù)制成功。

上述骨質(zhì)疏松模型復(fù)制成功大鼠分為4組:模型組、福善美治療組、運動治療組、運動與福善美聯(lián)合治療組，分別給予福善美灌胃和(或)跑臺運動干預(yù)治療12周后，福善美與運動單用或聯(lián)合治療均可顯著提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的BMD，且聯(lián)合運用效果較福善美、運動單獨治療顯著。這表明，福善美、運動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠均有治療作用，且運動可增強福善美單獨治療作用。

神經(jīng)傳導(dǎo)是反映患者神經(jīng)功能改變的重要指標(biāo)，包括MCV、ML和CMAP等主要指標(biāo)。MCV是肌電圖檢查中重要的檢查項目，它直接反映了運動神經(jīng)干的傳導(dǎo)功能;ML反映神經(jīng)傳導(dǎo)在運動終板(神經(jīng)－肌肉接頭)的突觸延擱時間;CMAP測得同一時刻點肌纖維興奮電壓的綜合，反映機體募集運動單位的能力。這3個指標(biāo)能夠客觀反映機體運動神經(jīng)傳導(dǎo)功能、肌肉功能和運動能力。我們用肌電圖儀檢測去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠干預(yù)治療12周后各組大鼠左側(cè)股神經(jīng)MCV、ML和CMAP。實驗結(jié)果顯示，運動可明顯改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能，使ML明顯縮短(P＜0.05 vs sham)，而福善美在改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能方面，并未顯示其優(yōu)勢。這說明，運動作為一種康復(fù)形式，能很大程度的改變卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松對神經(jīng)傳導(dǎo)的影響，這可能與運動增加NO合成量，增強突觸可塑性，促進損失的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)［14］;加強關(guān)節(jié)周圍肌肉的力量，增強關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，提高肌肉、關(guān)節(jié)周圍韌帶的伸展性［14］;增加骨密度，在壓力和張力作用下，骨小梁曲線排列整齊，從而增加骨的抗壓、抗扭轉(zhuǎn)、抗折和抗彎曲能力［14］等作用有關(guān)。

骨是具有新陳代謝的活組織，破骨細胞不段吸收舊骨，成骨細胞不斷形成新骨，骨形成和骨吸收緊密聯(lián)系形成骨重建(bone remodeling)。當(dāng)骨重建處于平衡狀態(tài)時，骨量維持穩(wěn)定。骨形成的相對減弱和骨吸收的相對增強即二者的偶聯(lián)障礙導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。骨代謝過程中新骨不斷形成，舊骨不斷被沉積到骨，同時又不斷地從骨中釋放到血循環(huán)中，通過測定血尿等骨生化標(biāo)志物可直接了解骨的生理和病理代謝變化［15］和骨轉(zhuǎn)換率，臨床上可作為骨質(zhì)疏松癥早期診斷的指標(biāo)之一［16］。PICP是OB合成的前膠原轉(zhuǎn)化為I型膠原過程中被等比例剪切掉的一種小分子多肽，因此PICP代表等量的骨膠原合成，是反映OB活性和膠原合成速率的特異指標(biāo)，也是反映骨轉(zhuǎn)換的敏感生化指標(biāo)［17］。PICP升高提示Ⅰ型膠原合成速率加快，進而可增加骨的韌性和強度。ICTP是I型膠原降解釋放出的含有8個氨基酸序列的小肽片段，只存在于I型膠原C末端，是目前唯一知道的I型膠原降解的特異性標(biāo)志物，是特異性骨吸收指標(biāo)［18］。正常情況下，I型膠原被降解甚微，ICTP在血中含量很少;在病理刺激下，破骨細胞活性增強，大量降解I型膠原，血中 ICTP含量增高［19－21］。

本實驗中，大鼠卵巢切除后PICP和ICTP較假手術(shù)組均顯著增高，說明卵巢切除大鼠處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。這是由于大鼠卵巢切除后，雌激素水平下降，骨吸收顯著增加;骨吸收增加又可通過偶聯(lián)激活骨形成，因此，大鼠骨形成和骨吸收水平均增高。但由于骨吸收大于骨形成，故表現(xiàn)為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松類型。福善美(阿倫膦酸鈉)能抑制骨吸收，其作用機制與干擾破骨細胞成熟、影響破骨細胞活性、改變骨特性有關(guān)。因此，運用福善美干涉治療去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠12周后，PICP和ICTP較模型組均顯著下降。運動和福善美聯(lián)合運用亦可降低PICP和ICTP，且聯(lián)合運用治療組PICP和ICTP指標(biāo)與運動單獨治療組比較，效果顯著提高。

此外，我們又采用2×2析因設(shè)計的方差分析統(tǒng)計方法，進一步考察福善美與運動之間是否存在交互作用。分析顯示，福善美與運動在各指標(biāo)間均無交互作用，而完全隨機設(shè)計的方差分析顯示，福善美與運動聯(lián)合運用較單獨使用效果顯著，這進一步提示，福善美與運動在治療骨質(zhì)疏松時單獨發(fā)揮作用，當(dāng)二者聯(lián)用時有疊加作用。

綜上可見，福善美和運動均可通過抑制骨吸收來改善骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，從而提高卵巢切除大鼠的骨密度值和改善其神經(jīng)傳導(dǎo)功能，且運動可增強福善美對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用。但運動和福善美是通過何種機制來抑制破骨細胞的骨吸收作用，還有待進一步研究。

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