遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)氧化應(yīng)激損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用*

別 曼， 徐 穎， 胡慧玲， 逯 丹， 朱麗紅， 戚仁斌， 王華東， 陸大祥△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，暨南大學(xué)腦科學(xué)研究所，國(guó)家中藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，2暨南大學(xué)－香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632;3中山大學(xué)中山眼科中心，廣東廣州510060)

視神經(jīng)損傷是眼科和神經(jīng)科的常見(jiàn)疾病，也是致盲的主要原因之一，病因涉及諸多因素。研究表明，外傷、青光眼［1］、缺血［2］及神經(jīng)軸突損傷等［3－4］因素造成的視神經(jīng)損傷，能夠引發(fā)視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而導(dǎo)致RGCs原發(fā)或(和)繼發(fā)性死亡，且死亡形式主要為細(xì)胞凋亡。

抗氧化的藥物目前有多種，如中藥類、維生素類及多糖類等。在中藥類藥物中，單體遠(yuǎn)志皂苷元(senegenin，Sen)在改善學(xué)習(xí)與記憶能力［5］、抗衰老［6］及抗氧化等［7］方面有顯著作用。本教研室的前期研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷元具有抑制Aβ25－35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，并且對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的PC12細(xì)胞，遠(yuǎn)志皂苷元也表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。然而遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)氧化應(yīng)激損傷的RGCs有何影響尚不清楚。本研究選取遠(yuǎn)志皂苷元作用于發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的RGCs，觀察其是否對(duì)損傷的RGCs有保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 出生3～5 d的SPF級(jí)Sprague－Dawley(SD)乳鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(粵)2006－0015。

1.2 主要試劑 熒光金(fluorogold，F(xiàn)G;Invitrogen)，neurobasal培養(yǎng)基(含 L－glutamine，Gibco)，甲基纖維素(methycellulose，Stemcell Technologies)，硫酸慶大霉素 (Amresco)，B27(Gibco)，L－谷氨酸鹽(Sigma)，木瓜蛋白酶 (Worthington)，L－半胱氨酸 (Sigma)，多聚賴氨酸(poly－L－lysine，PLL，Sigma)［8－9］，H2O2(廣州化學(xué)試劑廠)，Sen(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度＞98%)，β3－tubulin抗體 (CST)，熒光Ⅱ抗 Alexa Fluor 594(Invitrogen)，Hoechst 33258凋亡試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體 (CST)，Bcl－2 抗體(Abcam)，細(xì)胞色素 C抗體 (CST)，cleaved caspase－3抗體 (CST)。

1.3 儀器 超凈臺(tái)，CO2恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡(Leica－DFC 310FX)，微量進(jìn)樣器 (Hamilton，10 μL)，Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 上丘FG逆行標(biāo)記視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 取出生3～5 d SD大鼠，以囟點(diǎn)Bregma為起始點(diǎn)，水平旁開(kāi)1 mm處左右各取1點(diǎn)。每個(gè)點(diǎn)注射深度分別為2.0 mm和1.5 mm，0.6%FG溶液在每個(gè)深度注射量為1.25 μL。注射后微量進(jìn)樣器針頭留置2 min，每側(cè)注射總量為 2.5 μL［8－9］。

2.2 視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定

2.2.1 提前24 h在24孔板的孔內(nèi)鋪直徑1.3 cm的無(wú)菌圓玻片，0.1%PLL包被玻片。取提前3～4 d上丘FG標(biāo)記的SD乳鼠，無(wú)菌條件下取雙側(cè)視網(wǎng)膜，以5×105U/L木瓜蛋白酶37℃消化后，制備成混合細(xì)胞懸液［5－6］。測(cè)細(xì)胞密度為(4 ～8)×109/L。混合均勻后分到各孔中，每孔含細(xì)胞液體量達(dá)300 μL。待3 h細(xì)胞基本貼壁，再培養(yǎng)細(xì)胞15 h。之后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS液洗3遍，每次5 min。RGCs鑒定采用免疫細(xì)胞化學(xué)法，以β3－tubulin(1∶1 000)特異性標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。能被FG和β3－tubulin標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞即為視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

2.2.2 計(jì)算細(xì)胞活力 培養(yǎng)15 h，用4%多聚甲醛固定沖洗，抗熒光淬滅劑封片后，Leica熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)361 nm，發(fā)射波長(zhǎng)536 nm)觀察，×10視野拍照，×40視野計(jì)數(shù)。采用雙盲法計(jì)數(shù)［8－9］，在玻片上固定一點(diǎn)作為計(jì)數(shù)起始點(diǎn)，計(jì)數(shù)相鄰80個(gè)視野(×40)帶熒光RGCs的總和。只對(duì)熒光顯微鏡下FG熒光清晰、同時(shí)對(duì)應(yīng)白光視野下細(xì)胞形態(tài)完整的細(xì)胞納入計(jì)數(shù)范圍，其它情況不予計(jì)數(shù)。RGCs活力=各組帶熒光RGCs總數(shù)/control組帶熒光RGCs總數(shù)×100%，以control組RGCs數(shù)之和作為基數(shù)100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4～5次，算出每次各組的RGCs活力。

2.3 H2O2損傷RGCs模型的建立 隨機(jī)分為control組和 H2O24 個(gè)濃度(25、50、100、200 μmol/L)組。待細(xì)胞鋪板3 h貼壁后，加入含H2O2的培養(yǎng)液進(jìn)行損傷。15 h培養(yǎng)后計(jì)算RGCs活力。

2.4 Sen對(duì)氧化應(yīng)激損傷的RGCs的影響

2.4.1 Sen對(duì)正常RGCs的影響 隨機(jī)分為control組和 Sen 10、20、40、80、160 μmol/L 組。待細(xì)胞鋪板3 h左右貼壁后，更換含有不同濃度Sen的培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h。細(xì)胞固定封片后，計(jì)算RGCs活力。

2.4.2 Sen對(duì) H2O2損傷 RGCs的影響 隨機(jī)分為control組、0.1%DMSO 組、50 μmol/L H2O2組和H2O250 μmol/L+Sen(10、20 和 40 μmol/L)組。培養(yǎng)15 h后固定封片，計(jì)算RGCs活力。

2.5 視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和凋亡蛋白的表達(dá) 分離的視網(wǎng)膜體外培養(yǎng)，隨機(jī)分組為control組、50 μmol/L H2O2組、H2O250 μmol/L+Sen 40 μmol/L 組和 Sen 40 μmol/L組。培養(yǎng)15 h后，進(jìn)行如下處理。

2.5.1 Sen H2O2損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33258可以透過(guò)細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合后形成藍(lán)色熒光，常用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。視網(wǎng)膜細(xì)胞在處理后，棄去培養(yǎng)基加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2遍后，加入Hoechst 33258染液避光反應(yīng)5 min，PBS洗2遍后封片，熒光顯微鏡下拍照(激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm)。

2.5.2 Western blotting 檢測(cè)胞漿 Bcl－2、細(xì)胞色素C和cleaved caspase－3蛋白的表達(dá) 吸去板中培養(yǎng)液，每孔加60 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min后，轉(zhuǎn)移到離心管，4℃ 12 000 r/min離心5 min，上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中，－20℃保存。蛋白經(jīng)BCA法定量后，配置SDS－PAGE凝膠，上樣電泳，電轉(zhuǎn)蛋白，抗體孵育后顯影。結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH條帶的灰度比值來(lái)評(píng)定蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 逆行標(biāo)記和體外培養(yǎng)

1.1 FG標(biāo)記視網(wǎng)膜 FG通過(guò)軸漿逆向傳輸從上丘到達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。視網(wǎng)膜的矢狀切片(圖1A、B)可見(jiàn)被綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞位于視網(wǎng)膜的是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體層。視網(wǎng)膜平鋪片(圖1C、D)可以清楚看到整個(gè)視網(wǎng)膜滿布被FG標(biāo)記的RGCs，呈放射狀分布，圖中放射狀分布的黑線為血管，見(jiàn)圖1。

1.2 體外培養(yǎng) 視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體外培養(yǎng)能夠存活至少15 h，并能被FG和β3－tubulin成功雙標(biāo)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.RGCs were retrogradely labeled by fluorogold injection in superior colliculi.A，B:labeled RGCs in the retinal slice under fluorescent(A)and bright field(B);C:labeled RGCs in the retinal whole mount;D:enlarged area showed labeled RGCs.GCL:ganglion cell layer;IPL:inner plexiform layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;ONL:outer nuclear layer.圖1 上丘注射熒光金標(biāo)記視網(wǎng)膜的RGCs

Figure 2.In vitro cultured RGCs(indicated by the arrows)were labeled by fluorogold(A)and β3－tubulin(B).C:the corresponding bright field view.圖2 體外培養(yǎng)的RGCs

2 H2O2損傷RGCs模型建立

不同濃度H2O2損傷RGCs 30 min后RGCs活力見(jiàn)表1，H2O225、50、100 和200 μmol/L 各組RGCs活力與control組相比都下降，差異顯著(P＜0.05)。其中50 μmol/L H2O2損傷 RGCs 30 min 后，RGCs活力在60%～75%之間。因此選此濃度作為H2O2損傷RGCs 30 min的最適損傷濃度來(lái)建立損傷模型。

3 Sen對(duì)RGCs的影響

3.1 Sen對(duì)RGCs活力的影響 不同濃度Sen對(duì)RGCs活力的影響見(jiàn)表 1，Sen 10、20 和 40 μmol/L時(shí)，RGCs活力與control組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而 Sen 80和 160 μmol/L時(shí)，RGCs活力與control組相比活力顯著下降(P＜0.01)。因此選用Sen 10、20和40 μmol/L 3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 Sen對(duì)氧化應(yīng)激損傷RGCs活力的影響 H2O2損傷后，不同濃度Sen對(duì)RGCs的影響見(jiàn)圖3，與control組比較，H2O2組RGCs活力顯著下降 (P＜0.01)。在H2O2損傷后應(yīng)用10、20和40 μmol/L Sen處理，各組RGCs活力與H2O2組比較有顯著升高(P＜0.05)，且Sen濃度在40 μmol/L時(shí)，保護(hù)作用最佳。

表1 不同濃度H2O2和Sen對(duì)RGCs活力的影響Table 1.The RGCs viability after treatment with different concentrations of H2O2or Sen(%.±sE)

表1 不同濃度H2O2和Sen對(duì)RGCs活力的影響Table 1.The RGCs viability after treatment with different concentrations of H2O2or Sen(%.±sE)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

H2O2(n=4) RGCs viability Sen(n=5)RGCs viability Control 100.0 Control 100.00 25 μmol/L 78.4±0.5* 10 μmol/L 103.3 ±5.9 50 μmol/L 63.3±4.4* 20 μmol/L 102.4 ±6.0 100 μmol/L 58.1±4.4* 40 μmol/L 97.4 ±3.3 200 μmol/L 42.7±2.6 ＊＊ 80 μmol/L 84.7 ±2.4 ＊＊——160 μmol/L 79.3 ±2.7＊＊

Figure 3.Effects of Sen on the viability of H2O2－treated RGCs.RGCs were treated with 50 μmol/L H2O2or/and Sen at doses of 10，20 and 40 μmol/L for 15 h.±sE.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2.圖3 不同濃度Sen對(duì)H2O2損傷后RGCs活力的影響

4 凋亡相關(guān)的檢測(cè)結(jié)果

4.1 Hoechst 33258染色細(xì)胞形態(tài)觀察 Hoechst 33258染細(xì)胞核后發(fā)現(xiàn)，control組(圖4A)細(xì)胞核呈均一低強(qiáng)度熒光，可見(jiàn)少量高亮度的凋亡形態(tài)細(xì)胞核;H2O2組(圖4B)大量細(xì)胞核呈現(xiàn)高亮度濃染、核固縮狀態(tài)，凋亡形態(tài)特征的細(xì)胞多于control組;H2O2+Sen組(圖4C)高亮濃染、核固縮形態(tài)的細(xì)胞數(shù)少于H2O2組;而Sen組(圖4D)凋亡特征形態(tài)的細(xì)胞數(shù)少，多數(shù)細(xì)胞核呈現(xiàn)均一低強(qiáng)度熒光。

4.2 Sen對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

4.2.1 Bcl－2 蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示，與control組比較，H2O2組Bcl－2蛋白表達(dá)降低，差異顯著(P＜0.05);與H2O2組比較，H2O2+Sen 40 μmol/L組Bcl－2蛋白表達(dá)增高，差異顯著(P＜0.05);與 control組比較，Sen 40 μmol/L 組 Bcl－2蛋白表達(dá)增高，差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

4.2.2 細(xì)胞色素 C表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示，與control組比較，H2O2組細(xì)胞色素C表達(dá)升高，差異顯著(P＜0.01);與H2O2組比較，H2O2+Sen 40 μmol/L組細(xì)胞色素C表達(dá)降低，差異顯著(P＜0.01);與 control組比較，Sen 40 μmol/L 組細(xì)胞色素C表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖5。

4.2.3 Cleaved caspase－3 蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示，與 control組比較，H2O2組活化的caspase－3蛋白表達(dá)升高，差異顯著(P＜0.05);與H2O2組比較，H2O2+Sen 40 μmol/L 組活化的caspase－3蛋白表達(dá)降低，但無(wú)顯著差異(P＞0.05);與 control組比較，Sen 40 μmol/L 組活化的caspase3蛋白表達(dá)降低，差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 4.Effects of Sen on the apoptosis of H2O2－treated RGCsdetected using Hoechst 33258 staining.A:control;B:H2O250 μmol/L;C:H2O2+Sen 40 μmol/L;D:Sen 40 μmol/L.Apoptotic cells were indicated by arrows.圖4 Sen對(duì)氧化應(yīng)激損傷的RGCs凋亡的影響

討 論

活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)存在于細(xì)胞正常代謝過(guò)程中［10－13］，并且處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但在某些疾病或病理狀態(tài)如線粒體電子傳遞鏈被中斷后，ATP供應(yīng)充足時(shí)，ROS大量產(chǎn)生。大量研究已證實(shí)在海馬的神經(jīng)元［14］、交感神經(jīng)元［15］、小腦的顆粒細(xì)胞［16］及 RGCs 等［17］多種神經(jīng)細(xì)胞中，ROS在細(xì)胞死亡信號(hào)通路中都起到一定的作用。視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在軸突損傷后能發(fā)生氧化應(yīng)激而引起凋亡［18－19］，并且存在通過(guò)影響線粒體功能引起細(xì)胞凋亡［20］。及時(shí)阻斷凋亡發(fā)生，保護(hù)視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成為治療的關(guān)鍵。針對(duì)氧化應(yīng)激的發(fā)生，已證實(shí)某些中藥皂苷單體有較好的效果。遠(yuǎn)志皂苷元能夠有效保護(hù)體外培養(yǎng)的海馬的神經(jīng)元抵擋氧化應(yīng)激產(chǎn)物乙二醛［21］和 H2O2［22］的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)選擇遠(yuǎn)志皂苷元可以對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)RGCs的損傷，從而為RGCs的臨床保護(hù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 5.Effects of Sen(40 μmol/L)on the expression of Bcl－2，cytochrome C(Cyt C)and cleaved caspase－3 proteins in RGCs after H2O2(50 μmol/L)injury.±sE.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2.圖5 Sen對(duì)氧化應(yīng)激損傷的RGCs Bcl－2、細(xì)胞色素C和cleaved caspase－3蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)的RGCs損傷模型，觀察遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)損傷RGCs的作用及初步探討作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，50 μmol/L H2O2作用于培養(yǎng)3 h后貼壁的RGCs 30 min，即可造成對(duì)RGCs的氧化應(yīng)激損傷，神經(jīng)元的活力降低;而損傷后與Sen 40 μmol/L共培養(yǎng)15 h后，RGCs的活力顯著升高，這與有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似［21］。RGCs發(fā)生氧化應(yīng)激損傷后，細(xì)胞凋亡與線粒體途徑非常相關(guān)，其中Bcl－2家族、細(xì)胞色素C及caspase家族在其中又扮演非常關(guān)鍵的角色，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組比較，H2O2組的細(xì)胞色素C和cleaved caspase－3蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl－2蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.05);而H2O2+Sen 40 μmol/L組與 H2O2組相比，Bcl－2蛋白表達(dá)明顯增高，細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。cleaved caspase－3蛋白表達(dá)量也有降低。說(shuō)明Sen可能通過(guò)上調(diào)Bcl－2和下調(diào)促凋亡蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。

由此可見(jiàn)，Sen具有一定的抗氧化作用。其作用機(jī)制可能與穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)線粒體膜，減少細(xì)胞色素C的釋放，上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)有關(guān)。由于原代RGCs相對(duì)易損傷，其純化過(guò)程復(fù)雜，原代視網(wǎng)膜細(xì)胞混合培養(yǎng)模型又最接近于視網(wǎng)膜的正常生理狀態(tài)，因此是篩選有效藥物的首選模型。但對(duì)于機(jī)制的初步研究，此結(jié)果是建立在混合視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，其保護(hù)途徑究竟是只通過(guò)影響RGCs本身，還是同時(shí)也通過(guò)影響其它視網(wǎng)膜細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控，需要通過(guò)純化RGCs模型的進(jìn)一步驗(yàn)證，這也將成為下一步研究的重點(diǎn)。

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