干擾素誘導蛋白p204對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制*

龍向淑， 吳 強， 宋 方

(貴州省人民醫(yī)院心血管內科，貴州貴陽550002)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是構成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡失衡是動脈粥樣硬化、高血壓以及冠狀動脈介入治療術后再狹窄等血管增殖性疾病發(fā)病的主要病理生理機制。干擾素誘導蛋白p204(interferon－inducible protein p204)是干擾素(interferon，IFN)誘導蛋白p200家族(interferon－inducible protein 200 family，p200，IFI200)鼠類蛋白成員，其編碼基因Ifi204由Lengyel等［1］首先發(fā)現(xiàn)并成功克隆，其 mRNA約為2.2～2.3 kb，基因產(chǎn)物含640個氨基酸殘基，表觀分子量約72 kD。已有研究［2－4］表明，p204 可通過不同機制抑制多種細胞的增殖;且最近的研究顯示，p204可抑制大鼠VSMCs的增殖，p21可能參與了p204影響VSMCs增殖的下游調控［5］。生長因子在不同細胞通過不同的信號通路影響細胞增殖。本研究旨在進一步探討p204在抑制大鼠VSMCs增殖的過程中與相關細胞增殖信號通路之間可能存在的關系。

材料和方法

1 大鼠VSMCs的培養(yǎng)和實驗分組

純種SD大鼠(雌雄不拘)3只(購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)，體重 120 ～140 g，按文獻［6］介紹的方法進行胸主動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)、純化及鑒定。細胞培養(yǎng)及鑒定所用主要試劑DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone;α－SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。取4－6代細胞用于實驗。實驗分為4組，即空白陰性對照組(negative group，N)、非特異性 siRNA組(control siRNA group，C)、IFN － α 誘導組(IFN－ α induction group，IFN)和 Ifi204 siRNA轉染組(Ifi204 siRNA transfection group，siRNA)。干預所用藥物IFN－α購自北京三元基因工程有限公司。轉染試劑control siRNA －A(sc－36869)購自Santa Cruz;Ifi204 siRNA由寶生物工程(大連)有限公司合成，見表1;LipofectamineTM2000 reagent購自Invitrogen。各組干預6 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞。

表1 siRNA及引物序列Table 1.The sequences of primers and siRNA

2 實時qRT－PCR法檢測mRNA表達

按TRNzol總RNA提取試劑盒(購自北京天根公司)說明操作提取細胞總RNA，按RT－PCR兩步法試劑盒(DRR047A，購自TaKaRa)說明書逆轉錄合成cDNA，然后按DRR420A試劑盒(購自TaKaRa)說明書操作進行實時qRT－PCR擴增。PCR擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，見表1。按2－ΔΔCt法計算 p204 mRNA 的表達量。

3 Western blotting檢測蛋白表達

按文獻［7］介紹的方法進行蛋白樣品的制備、定量、分離、轉膜、印跡，從而測定特定蛋白的相對含量。使用的主要試劑p204抗體(sc－13367)購自Santa Cruz;Tubulin抗體(AT819)購自碧云天;Ras(ab108602)、p－Raf(ab78334)、p－ERK 44/42(ab47339)、p－Akt(ab78403)和 p－p38(ab32557)均購自Abcam。

4 MTT檢測細胞活力

收集對數(shù)生長期細胞，按3 000 cells/well接種于96孔板，各組干預方法同上述實驗。培養(yǎng)板用平板離心機4 000 r/min離心5 min，充分吸盡上清。每孔加入150 μL DMSO，置旋轉搖床上低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值。涉及的主要試劑四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5 －diphenyltetrazolium bromide，MTT］購自 Sigma。

5 流式細胞術檢測細胞周期

按細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(C1052，購自碧云天公司)說明書操作收集細胞、染色后采用配套軟件進行細胞DNA含量分析。

6 統(tǒng)計學處理

結 果

1 p204在VSMCs的基礎表達和干預因素的影響

實時qRT－PCR和 Western blotting顯示，p204在N組存在一定豐度的基礎表達。與N組比較，IFN組的p204 mRNA與蛋白表達上調(P＜0.05)，siRNA組的p204 mRNA與蛋白表達下調(P＜0.05)，而C組與N組相比無顯著差異，見圖1～3及表2。

Figure 1.The curves of amplification and melting of p204 and GAPDH in real－time qRT－PCR.圖1 p204和GAPDH real－time qRT－PCR擴增曲線和熔解曲線

2 p204表達對VSMCs增殖的影響

與N組比較，IFN組 MTT的 A值降低(P＜0.05);G0/G1期細胞增多，S期細胞減少(P＜0.05);siRNA組MTT的A值增高(P＜0.05)，G0/G1期細胞減少，S期細胞增多(P＜0.05);而C組與N組的上述指標間差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

3 p204表達對相關細胞增殖信號通路的影響

與N組比較，IFN組Ras蛋白表達和Raf及ERK的磷酸化水平下調(P＜0.05)，siRNA組Ras蛋白表達和Raf及ERK的磷酸化水平上調(P＜0.05)，而C組與N組的上述指標間差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。4組間的p38 MAPK或Akt磷酸化水平的差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。

表2 干預因素對p204 mRNA表達的影響Table 2.Effects of intervention factors on p204 mRNA expression(±s.n=3)

表2 干預因素對p204 mRNA表達的影響Table 2.Effects of intervention factors on p204 mRNA expression(±s.n=3)

N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P ＜0.05 vs negative group.

Group Ct ΔCt 2 －ΔΔCt p204 GAPDH N 19.15 ±0.23 16.78 ±0.36 2.37 1.00 C 19.33 ±0.56 16.83 ±0.26 2.50 0.91 IFN 17.22 ±0.38 17.08 ±0.09 0.14 4.69*siRNA 20.99 ±0.22 16.95 ±0.21 4.04 0.31*

表3 p204表達變化對VSMCs增殖及細胞周期的影響Table 3.Effects of p204 expression variation on cell cycle and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

表3 p204表達變化對VSMCs增殖及細胞周期的影響Table 3.Effects of p204 expression variation on cell cycle and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P＜0.05 vs negative group.

N*

Figure 2.Effects of p204 expression variation on Ras/Raf/ERK signal pathway.±s.n=3.*P＜0.05 vs negative group.N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖2 p204表達變化對Ras/Raf/ERK信號通路的影響

Figure 3.Effects of p204 expression variation on phosphorylation of p38 and Akt.±s.n=3.*P＜0.05 vs negative group of p204 protein.N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖3 p204表達變化對p38及Akt磷酸化水平的影響

討 論

VSMCs過度增殖是血管增殖性疾病發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，因此，研究如何采取有效措施抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移以及表型轉化等是血管增殖性疾病領域研究的熱點。

IFN是一組具有抗病毒、抗增殖、影響細胞生長和分化、調節(jié)免疫應答等眾多生物學功能的活性細胞因子家族［8］。IFN與相應受體結合誘導一系列效應分子的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗病毒、影響細胞增殖等作用［9］。p204是IFN誘導蛋白p200家族蛋白的鼠類成員。分子結構上，p204氨基端起始部含有一個由88個氨基酸殘基構成的DAPIN結構域，在其羧基端含有兩個相連的200A和200B。p204通過其特定的結構域介導IFN應答及與凋亡和炎癥信號通路蛋白(如 p53、pRb 和 Ras等)之間的結合［1］，發(fā)揮其調節(jié)細胞增殖、分化及遷移等生物學功能。本研究結果顯示，誘導p204 mRNA和蛋白表達增多，VSMCs增殖受到抑制，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少;相反，抑制p204 mRNA和蛋白表達后，VSMCs增殖明顯，G0/G1期細胞減少，S期細胞增多。表明p204蛋白具有抑制VSMCs增殖及細胞周期G1/S轉換的作用。

細胞增殖是細胞外刺激信號作用于細胞膜或胞質受體，經(jīng)細胞內信號傳遞使細胞周期改變?yōu)橹鞯木C合性細胞行為，細胞內信號傳遞過程就成為細胞能否增殖的關鍵。絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)家族是細胞內信號蛋白網(wǎng)絡中重要的一員，主要介導細胞的發(fā)生、分化、增殖、凋亡及細胞間的功能同步等多種生理過程。目前至少鑒定出4種MAPK家族成員，分別為細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)、c－Jun N端激酶/應激活化蛋白激酶、p38 MAPK 及 ERK5［10］。Ras和 Raf為 ERK 活化的上游信號蛋白，Ras在細胞外信號刺激下，轉化為激活型Ras，激活型Ras磷酸化活化Raf，活化的Raf再激活MEK，MEK經(jīng)磷酸化最終激活 ERK，活化的ERK入核，啟動相應轉錄子的轉錄。Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約60 kD，Akt的活化亦可影響細胞的增殖、凋亡及衰老等生物學功能。p204可通過其200X結構域中的保守模序MF/LHATVAT/S與p53蛋白直接結合，調節(jié)p53介導的轉錄調控是其抑制細胞增殖的主要機制之一。p53可在轉錄水平促進p21表達，亦可抑制ras基因及myc基因協(xié)同作用引起的細胞增殖［11］。本研究結果顯示，誘導p204蛋白表達上調，抑制VSMCs增殖的同時，Ras蛋白表達減少，其下游信號蛋白Raf和ERK磷酸化水平亦隨之下降;反之，通過RNA干擾抑制p204表達，促進VSMCs增殖，則伴隨Ras蛋白表達增多，Ras信號通路下游信號蛋白Raf和ERK磷酸化水平亦升高。然而在上述過程中，對細胞增殖亦有重要影響的信號通路p38 MAPK及PI3K/Akt在VSMCs的磷酸化水平卻未出現(xiàn)明顯變化。故認為p204可能通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路抑制VSMCs的增殖，而與p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路無關。

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