siRNA下調(diào)RRM2抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖與遷移及其裸鼠皮下移植瘤的生長

郭紹文， 林 韻， 李澤民△

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院病理科，上海200021;2上海市東方醫(yī)院腫瘤科，上海200120)

核糖核苷酸還原酶 (ribonucleotide reductase，RR)是RNA合成的前體，參與核糖核苷酸還原成脫氧核糖核苷酸的過程，在核苷酸代謝過程中發(fā)揮中心作用，是唯一催化核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷酸的酶，是 DNA合成和修復(fù)的限速酶［1］。人的RR包括2個(gè)亞基，即RRM1和RRM2，這2個(gè)亞基在不同的染色體上被不同的基因編碼，由不同的mRNA表達(dá)。

RR的活性主要受RRM2表達(dá)水平的調(diào)節(jié)［2］，RRM2在很多腫瘤中都高表達(dá)［3］，而RRM2的高表達(dá)往往與腫瘤的化療耐受［4］、侵襲能力強(qiáng)［5］和預(yù)后差［6］關(guān)系密切，這些研究提示RRM2可能是治療腫瘤的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7% ～10%，而有關(guān)以RRM2為靶點(diǎn)治療乳腺癌的研究報(bào)道并不多，因此，本課題利用RNA干擾技術(shù)［7］，評(píng)價(jià)了下調(diào)RRM2基因后人乳腺癌細(xì)胞系MCF－7體外的增殖和遷移情況及其體內(nèi)成瘤能力，以期為乳腺癌的基因治療提供有意義的理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料和試劑

1.1 細(xì)胞系及小鼠 人乳腺癌細(xì)胞MCF－7和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 (ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室凍存。MCF－7于DMEM培養(yǎng)液 (含10% 胎牛血清、青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)，MCF－10A于DMEM/F12培養(yǎng)液 (5% 胎牛血清，20 μg/L EGF，500 μg/L 氫化可的松，100 μg/L胰島素和2 mmol/L L－谷氨酰胺)，兩細(xì)胞都是 37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。BALB/c裸鼠18只，雌性，5周齡，體重約20g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心。

1.2 主要試劑及儀器 鼠抗人RRM2單抗購于Abcam;辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的人GAPDH抗體購于上?？党缮锕こ逃邢薰?Cell Counting Kit－8(簡稱CCK－8)試劑盒購于Dojindo。Western blotting試劑盒購于 Sigma?？俁NA提取試劑 Trizol、RT－PCR試劑盒 (大連TaKa-Ra)。CO2培養(yǎng)箱 (NU－3500)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀 (ABI7500)。

2 方法

2.1 siRNA設(shè)計(jì) RRM2小干擾 RNA(siRNARRM2，序列參照文獻(xiàn)［8］報(bào)道)及陰性對(duì)照 (siRNA－NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 合成的siRNA－RRM2及陰性對(duì)照siRNA序列Table 1.The chemically synthesized sequences of siRNA －RRM2 and negative control siRNA

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 按Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%的融合度時(shí)于6孔板中分組轉(zhuǎn)染:空白對(duì)照組(NEG，加PBS)、陰性對(duì)照組(siRNA－NC)和實(shí)驗(yàn)組 (siRNA－RRM2)。轉(zhuǎn)染8 h后更換為新鮮的相應(yīng)培養(yǎng)液。

2.3 Real－time PCR檢測mRNA表達(dá) 用Trizol一步抽提法提取細(xì)胞總RNA［9］，用TaKaRa RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RRM2正義鏈5＇－GCTTGGTCGACAAGGAGAAC －3＇和反義鏈 5＇－CCTCTGCCTTCTTATACATCTG －3＇。人 GAPDH 正義鏈5＇－ GCTGAGTACGTCGTGGAGTC－3＇和反義鏈 5＇－AGGCATTGCTGATGATCTTG－3’。寡核苷酸引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。按照SYBR Green System(TaKaRa)試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。以人GAPDH作為內(nèi)參照，比較閾值法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) MCF－7細(xì)胞以每孔1.5×105鋪于24孔板，過夜。siRNA轉(zhuǎn)染8 h，胰酶消化后無血清培養(yǎng)基種于孔徑8 μm的Transwell小室中，孔底加10%FCS的培養(yǎng)液。48 h后，用棉簽擦凈未遷移的細(xì)胞，后用結(jié)晶紫染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 CCK－8法檢測細(xì)胞增殖

2.5.1 劑量效應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染3個(gè)濃度(50 nmol/L、150 nmol/L和300 nmol/L)的siRNA－RRM2和陰性對(duì)照siRNA－NC，并設(shè)空白組，轉(zhuǎn)染48 h后吸取培養(yǎng)液，PBS洗2遍后每孔加入100 μL CCK－8混合液 (含10 μL CCK－8試劑，90 μL相應(yīng)培養(yǎng)液)繼續(xù)孵箱培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度值。

2.5.2 時(shí)間效應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板 (每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染siRNA－RRM2(終濃度150 nmol/L)和陰性對(duì)照siRNA－NC(終濃度150 nmol/L)，并設(shè)NEG組和空白孔組，分別于轉(zhuǎn)染24、48、96 h后吸取培養(yǎng)液，PBS洗2遍后每孔加入100 μL CCK －8 混合液 (含 10 μL CCK －8 試劑，90 μL相應(yīng)培養(yǎng)液)繼續(xù)孵箱培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度值。

繪制細(xì)胞生長曲線。根據(jù)公式:細(xì)胞增殖率 =(NEG組－處理組)/NEG組－空白孔組，計(jì)算增殖率。

2.6 Weatern blotting檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞鋪于6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后吸除培養(yǎng)液，用PBS洗2次，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取50 μg蛋白上樣，12%SDS－PAGE電泳分離轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，10%脫脂奶封閉2 h，加入Ⅰ抗小鼠抗人RRM2抗體 (1∶1 000稀釋)4℃過夜或人HRP標(biāo)記GAPDH(內(nèi)參照)抗體 (1∶5 000)1 h，用 PBST洗膜10 min×3次，山羊抗小鼠HRP標(biāo)記Ⅱ抗 (1∶5 000)于室溫下孵育1 h，用ECL發(fā)光，膠片顯色。

2.7 裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn) 乳腺癌細(xì)胞MCF－7分3組，分別是轉(zhuǎn)染siRNA－RRM2組、轉(zhuǎn)染siRNA－NC組和未處理NEG組。裸鼠也隨機(jī)分成相應(yīng)的3組，每組6只，上述轉(zhuǎn)染8 h后，按每只5×106個(gè)細(xì)胞分別皮下接種于這3組BALB/c裸鼠右頸部，繼續(xù)飼養(yǎng)，并觀察腫瘤生長情況。按公式V=1/2×a×b2(V:瘤體積;a:長徑;b:短徑)計(jì)算腫瘤體積，繪制生長曲線。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。

結(jié) 果

1 RRM2在人乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)

Real－time PCR結(jié)果顯示MCF－7細(xì)胞RRM2 mRNA表達(dá)水平約是MCF－10A的2倍，Western blotting結(jié)果顯示，MCF－7細(xì)胞RRM2蛋白表達(dá)顯著高于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A的表達(dá)，說明RRM2在人乳腺癌細(xì)胞MCF－7中相對(duì)于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A過表達(dá)，見圖1。

Figure 1.Expression levels of RRM2 mRNA(A)and protein(B)in MCF－7 and MCF－10A cells.±s.n=5.＊＊P ＜0.05 vs MCF －10A.圖1 人乳腺癌細(xì)胞MCF－7和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A中RRM2 mRNA與蛋白的表達(dá)

2 siRNA－RRM2劑量及時(shí)間依賴性地抑制RRM2 mRNA表達(dá)

不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染MCF－7細(xì)胞48 h后，siRNA－RRM2組與其它組相比抑制RRM2 mRNA表達(dá)的效果隨濃度的增加而增高，具有劑量依賴性，見圖2A。150 nmol/L siRNA －RRM2轉(zhuǎn)染24、48、96 h后，抑制效果隨時(shí)間的增加而增高，具時(shí)間依賴性，見圖2B。siRNA－RRM2抑制RRM2 mRNA表達(dá)的效果與其它組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 RRM2下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

50 nmol/L、150 nmol/L和300 nmol/L siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，人乳腺癌細(xì)胞MCF－7轉(zhuǎn)染siRNA－RRM2組與對(duì)照組siRNA－NC和空白對(duì)照組相比細(xì)胞增殖明顯受到抑制，且隨siRNA濃度增加抑制效果更明顯，見圖3A，差異顯著(P＜0.05)。150 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48和96 h后，人乳腺癌細(xì)胞MCF－7轉(zhuǎn)染siRNA－RRM2組與轉(zhuǎn)染對(duì)照組siRNA－NC和空白對(duì)照組相比細(xì)胞增殖明顯受到抑制，且隨時(shí)間增加抑制效果更明顯，見圖3B，差異顯著 (P＜0.05)。而150 nmol/L siRNA－RRM2轉(zhuǎn)染人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A 48 h后對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著影響，見圖3C。

Figure 2.Knockdown of RRM2 expression in MCF －7 cell line by specific siRNA at different concentrations and different time points.±s.n=5.*P＜0.05 vs other groups.圖2 不同時(shí)點(diǎn)、不同濃度siRNA－RRM2轉(zhuǎn)染對(duì)MCF－7 RRM2 mRNA表達(dá)的影響

Figure 3.The proliferation of MCF－7 and MCF－10A cells after siRNA－RRM2 transfection at different concentrations and different time points.A:48 h after transfection at different concentrations(MCF －7 cells);B:transfection(150 nmol/L)at different time points(MCF－7 cells);C:48 h after transfection(150 nmol/L，MCF－10A cells).±s.n=5.*P＜0.05 vs other groups.圖3 siRNA下調(diào)RRM2基因后MCF－7和MCF－10A細(xì)胞的增殖情況

4 siRNA－RRM2抑制MCF－7細(xì)胞遷移

150 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染siRNARRM2組與轉(zhuǎn)染siRNA－NC組相比具有明顯抑制MCF－7細(xì)胞遷移的作用 ，見圖4。

Figure 4.Effect of RRM2 silencing on cell migration(crystal violet staining，×200).±s.n=5.*P＜0.05 vs siRNA－NC.圖4 siRNA下調(diào)RRM2基因后MCF－7細(xì)胞的遷移情況

5 siRNA－RRM2對(duì)裸鼠移植瘤生長影響

siRNA－RRM2組中裸鼠腫瘤生長明顯緩慢，體積明顯小于siRNA－NC組和空白組 (P＜0.05)，而siRNA－NC組和空白組裸鼠腫瘤體積之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖5。

討 論

本研究首先檢測了RRM2在人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A和人乳腺癌細(xì)胞MCF－7中表達(dá)情況，結(jié)果顯示RRM2在MCF－7細(xì)胞中mRNA及蛋白比在MCF－10A細(xì)胞中顯著高表達(dá)。RRM2的過表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞的 Raf蛋白表達(dá)增加，并使MAPK2和Rac的活性增加，提示RRM2可直接影響腫瘤的生物學(xué)行為［10］。依賴c－Myc的RRM2基因擴(kuò)增顯示基因組的不穩(wěn)定性且與腫瘤的潛在形成有關(guān)［11］，cAMP、Ras和蛋白激酶 C 等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可調(diào)節(jié)RRM2的表達(dá)，同時(shí)這些途徑是腫瘤惡化所必需的，這些研究成果提示下調(diào)腫瘤中RRM2的表達(dá)是一個(gè)潛在的治療策略。

Figure 5.The tumor growth in nude mice after RRM2 silencing.±s.n=5.*P＜0.05 vs siRNA－RRM2 group.圖5 裸鼠接種RRM2基因沉默的MCF－7細(xì)胞后腫瘤的生長情況

RRM2與許多癌基因一起協(xié)同作用決定細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成潛能，Zhou等［12］通過轉(zhuǎn)染使人口咽腔表皮樣癌細(xì)胞的RRM2過度表達(dá)，結(jié)果使癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，并在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)肺部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移也明顯增加。Duxbury等［13］采用 RNAi干擾技術(shù)抑制胰腺癌細(xì)胞中RRM2的表達(dá)，可使胰腺癌細(xì)胞凋亡并降低癌細(xì)胞的侵襲能力，這些研究結(jié)果與我們在乳腺癌模型中的研究結(jié)果相一致。

RRM2高表達(dá)會(huì)大大增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的抵抗力，會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，因此RR抑制劑類的抗腫瘤藥物是非常具有開發(fā)前途的［14］。目前在乳腺癌治療中已經(jīng)采用針對(duì)RRM2 mRNA的反義藥物GTI－2040抑制RR的表達(dá)以增強(qiáng)治療效果［15］。本研究發(fā)現(xiàn)通過siRNA干擾RRM2的表達(dá)，對(duì)人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF－10A體外增殖和遷移沒有影響，但卻可顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF－7的增殖和其遷移能力，并非常明顯地抑制其在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。

綜上，抑制RRM2表達(dá)對(duì)乳腺癌腫瘤治療具有重大意義，而特異沉默RRM2基因可作為一種很好的治療策略。本研究用siRNA干擾技術(shù)特異下調(diào)RRM2表達(dá)，并在體內(nèi)外顯示了良好的抗腫瘤效果，這些為乳腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究提供了參考，并提示RRM2可能是在乳腺癌治療中潛在的有意義的靶點(diǎn)。

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