實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)方法的建立

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，廣泛存在于空氣和水中，是人和動(dòng)物體表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常見菌，也是一種條件性致病菌。金黃色葡萄球菌可引起人和動(dòng)物皮膚軟組織感染、敗血癥、乳房炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎、筋膜炎、關(guān)節(jié)炎、中毒性休克綜合征等。對(duì)于實(shí)驗(yàn)大、小鼠，可引起化膿性睪丸炎、前列腺炎、卵巢膿腫、子宮內(nèi)膜炎等，嚴(yán)重影響鼠群繁育和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1］。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14922.2-2011《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》將金黃色葡萄球菌列為SPF級(jí)大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠和兔等嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須檢測(cè)和排除的病原菌。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢測(cè)通常采用分離培養(yǎng)和生化鑒定相結(jié)合的方法，這種方法至少需要5d。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)基因體外擴(kuò)增的技術(shù)，利用4條不同的引物特異性地識(shí)別目的基因上面的6個(gè)特定序列，借助具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下催化新鏈的合成［2］。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入 SYBR green I，綠色為陽(yáng)性，橙色為陰性，可以直接肉眼觀察判定結(jié)果。該技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各領(lǐng)域。本研究將LAMP技術(shù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)目的基因高效、快速的擴(kuò)增，大大提高了檢測(cè)效率、降低了檢測(cè)成本。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923由本實(shí)驗(yàn)室保藏；金黃色葡萄球菌、沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、肺炎克雷伯菌均為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 主要試劑：細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒購(gòu)自AxyPrep公司；Bst DNA Polymerase購(gòu)自 NEB公司；Betaine購(gòu)自Sigma公司；dNTP m ixture、MgCl2、購(gòu)自 TaKaRa寶生物(大連)工程有限公司；SYBR green I熒光染料購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；DEPC水購(gòu)自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)金黃色葡萄球菌特有的nuc基因，利用Primer Explorer IV設(shè)計(jì)4條引物［3］，由北京閱微基因技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.2.2 菌株培養(yǎng)：金黃色葡萄球菌ATCC 25923接種于血瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)18h～24h，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。取100μL菌液用于稀釋與計(jì)數(shù)，其余菌液6000r/m in離心30min，收集菌體溶于 DEPC水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 金黃色葡萄球菌的稀釋與計(jì)數(shù)：取100μL增菌培養(yǎng)后的菌液，用無菌PBS進(jìn)行10倍遞增稀釋，每個(gè)稀釋度吸取100μL接種到血瓊脂平板上，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿，L棒涂布均勻，于37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 模板制備：采用熱裂解法制備粗制模板［4］。取50μL菌液溶于50μL DEPC水，電磁爐煮沸10m in，12000r/m in離心 5m in，取上清液為粗制模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)：

1.2.5.1 25μL擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件［5］：1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/L F3、0.2μmol/L B3、1.6mmol/L dNTP、4mmol/L MgCl2、0.8mol/L betaine、LAMP buffer(20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4、0.1%TritonX-100)、1μL模板、8U Bst酶。加入模板后煮沸5min，4℃ 3min，再加入Bst酶，60℃ 60min，80℃ 3min，4℃保存。

1.2.5.2 特異性試驗(yàn)：按照1.2.5.1的25μL擴(kuò)增體系配制反應(yīng)液，分別以金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、金黃色葡萄球菌、沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、肺炎克雷伯菌的粗提DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5.3 優(yōu)化反應(yīng)體系：按照1.2.5.1的25μL擴(kuò)增體系配制反應(yīng)液，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923的粗提DNA為模板，對(duì)LAMP反應(yīng)體系中的dNTP濃度、Mg2+濃度和betaine濃度以及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

表1 引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers

1.2.5.4 靈敏性試驗(yàn)：按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。將模板濃度做倍比稀釋，使每個(gè)反應(yīng)體系的模板量為1cfu、2cfu、3cfu、4cfu、5cfu、10cfu。

1.2.5.5 方法驗(yàn)證：取20粒SPF級(jí)小鼠糞便。經(jīng)分離培養(yǎng)和生化鑒定［6］證實(shí)有表皮葡萄球菌存在。將20份樣品隨機(jī)平均分為兩組，每組中5份樣品混入少量金黃色葡萄球菌 ATCC 25923。一組粗提DNA為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，編號(hào)為1～10，11號(hào)為空白對(duì)照；另一組用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取DNA為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，編號(hào)為1'～10'，11'號(hào)為空白對(duì)照。按照優(yōu)化后的25μL擴(kuò)增體系配制反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物以5μL上樣進(jìn)行凝膠電泳觀察結(jié)果，粗提DNA的一組每管剩余20μL加入2μL 100×SYBR green I(以無水DMSO將10000×SYBR green I稀釋100倍)肉眼直接觀察，橙色為陰性，綠色為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)

對(duì)供試菌株分別進(jìn)行LAMP。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌反應(yīng)管電泳結(jié)果均呈陽(yáng)性，而其他菌株反應(yīng)管電泳結(jié)果均呈陰性(見圖1)，說明所設(shè)計(jì)的引物具有極強(qiáng)的特異性。

圖1 引物特異性凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of the LAMP-amplified DNA using specific primersNote： M： marker DL500；1： Staphylococcus aureus ATCC25923；2：Staphylococcus aureus；3：Salmonella spp.；4：Yersinia enterocolitica；5： Yersinia pseudotuberculosis；6：Klebsiella pneumoniae；7：blank control.

2.2 優(yōu)化反應(yīng)體系

2.2.1 dNTP濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響：由圖2可見，dNTP的濃度為1.6mmol/L～2.0mmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出靶DNA。當(dāng)dNTP的濃度達(dá)到2.0mmol/L時(shí)，就能夠得到均一、穩(wěn)定的條帶，繼續(xù)增加dNTP濃度至2.4mmol/L，擴(kuò)增效率稍有降低。

2.2.2 Mg2+濃度對(duì) LAMP反應(yīng)的影響：由圖3可見，Mg2+的濃度為2mmol/L～7 mmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出靶DNA。當(dāng)Mg2+的濃度達(dá)到6mmol/L時(shí)，就能夠得到均一、穩(wěn)定的條帶，繼續(xù)增加Mg2+濃度至7 mmol/L，擴(kuò)增效率稍有降低。

2.2.3 Betaine濃度對(duì) LAMP反應(yīng)的影響：由圖4可見，當(dāng)betaine的濃度在0.6mol/L～1.0mol/L范圍內(nèi)時(shí)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的影響并不大，但仍可見當(dāng)betaine的濃度達(dá)到0.8mol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最好。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP反應(yīng)的影響：在電泳30min時(shí)就能觀察到特異性條帶，但在60min才能得到均一、穩(wěn)定的電泳條帶(圖5)。

圖2 dNTP濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of dNTP concentration on the LAMP reaction Note：M：marker DL500；1：dNTP 0.4mmol/L；2：dNTP 0.8mmol/L；3：dNTP 1.2mmol/L；4：dNTP 1.6mmol/L；5：dNTP 2.0 mmol/L；6：dNTP 2.4mmol/L；7：blank control.

圖3 Mg2+濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of Mg2+concentration on the LAMP reaction Note：M：marker DL500；1：Mg2+2mmol/L；2：Mg2+ 3mmol/L；3：Mg2+4mmol/L；4：Mg2+5mmol/L；5：Mg2+ 6mmol/L；6：Mg2+7 mmol/L；7：Mg2+8mmol/L；8：blank control.

2.3 敏感性試驗(yàn)

根據(jù)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整金黃色葡萄球菌LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的特異性引物在最佳反應(yīng)條件下，最低可檢測(cè)到2cfu熱裂解法粗提DNA的金黃色葡萄球菌。(圖6)

圖4 Betaine濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of betaine concentration on the LAMP reactionNote：M：marker DL500；1：Betaine 0.6M；2：Betaine 0.7 mol/L；3：Betaine 0.8mol/L；4：Betaine 0.9 mol/L；5：Betaine 1.0mol/L；6：Betaine 1.1mol/L；7：blank control.

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of reaction time on the LAMP reaction Note：M：marker DL500；1：20min；2：30min；3：40min；4：50min；5：60min；6：blank control.

圖6 LAMP敏感性電泳結(jié)果Fig.6 Agarose gel electrophoretogram of LAMP-amplifiedDNA of SA at different DNA concentrationNote：M：marker DL500；1：1cfu；2：2cfu；3：3cfu；4：4cfu；5：5cfu；6：10cfu；7：blank control.

2.4 方法驗(yàn)證

對(duì)供試糞便樣品分別進(jìn)行用LAMP進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，未添加金黃色葡萄球菌ATCC 25923的供試樣品凝膠電泳結(jié)果均呈陰性，添加金黃色葡萄球菌ATCC 25923的供試樣品凝膠電泳結(jié)果均呈陽(yáng)性(圖7)，說明引物對(duì)表皮葡萄球菌并無交叉反應(yīng)。同時(shí)，肉眼直接觀察加入SYBR Green I熒光染料的反應(yīng)管，1～5為橙色、6～10為淡綠色、11為橙色，與凝膠電泳結(jié)果相同。

圖7 LAMP瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.7 Results of of LAMP-agarose gel electrophoresisNote：M：Marker DL500；1～5：stool samples of SPF mice processed by thermal cracking；6～10：Thermal cracking stool samples added with Staphylococcus aureus ATCC25923of SPF mice processed by thermal cracking；11：Blank control；1'～5'：Stool samples of SPF mice processed by kit；6'～10'：Stool samples added with Staphylococcus aureus ATCC25923of SPF m ice processed by kit；11'：Blank control.

3 討論

根據(jù)生物學(xué)特性、表型特征鑒定細(xì)菌的傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的檢測(cè)方法，這種方法存在許多不足之處：耗時(shí)長(zhǎng)且步驟繁瑣，要求有經(jīng)驗(yàn)非常豐富的科研人員，并且這些方法很容易出現(xiàn)漏檢。PCR技術(shù)雖然越來越多地被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)，但是因?yàn)樾枰厥獾膬x器，并且容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增使得它在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)中的應(yīng)用受到限制。LAMP技術(shù)較常規(guī)的PCR技術(shù)操作更簡(jiǎn)單；無需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，反應(yīng)不需要控制溫度的變化，僅需一臺(tái)水浴鍋就可完成整個(gè)擴(kuò)增過程；結(jié)果判定簡(jiǎn)便，可直接根據(jù)有無焦磷酸鎂沉淀的生成，或者根據(jù)加入熒光染料SYBR green I后顏色的變化，直接肉眼觀測(cè)結(jié)果，省去PCR中的變溫過程和電泳觀察結(jié)果的步驟，大大縮短試驗(yàn)時(shí)間；另外4條引物必須完全匹配才能進(jìn)行擴(kuò)增使得LAMP技術(shù)比PCR技術(shù)具有更強(qiáng)的特異性。故LAMP技術(shù)能夠滿足基層、現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)、大批量樣本檢測(cè)的需要，克服了傳統(tǒng)PCR方法的不足之處。

金黃色葡萄球菌的nuc基因編碼耐熱核酸酶，位于染色體上，長(zhǎng)966bp。Brakstad等［7］人分別應(yīng)用PCR的方法證明了nuc基因只存在于金黃色葡萄球菌中，而在其他葡萄球菌和非葡萄球菌中均不存在，是金黃色葡萄球菌的高特異性基因。

本研究針對(duì)金黃色葡萄球菌特異性的nuc基因設(shè)計(jì)的LAMP技術(shù)是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、操作極其簡(jiǎn)便的快速檢測(cè)方法。在25μL的LAMP體系中(1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/L F3、0.2μmol/L B3、2.0mmol/L dNTP、6mmol/L MgCl2、0.8mol/L betaine、20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4、0.1% ritonX-100、模板 DNA、8U BstDNA聚合酶)僅需要40min～60min，就可以清晰檢測(cè)出2cfu粗提DNA的金黃色葡萄球菌。擴(kuò)增結(jié)束后直接在反應(yīng)管中加入只與雙鏈DNA結(jié)合的SYBR green I可通過陽(yáng)性結(jié)果呈綠色、陰性結(jié)果呈橙色，肉眼直接判定結(jié)果。從提取 DNA開始，在1.5h～2h內(nèi)即可完成全部檢測(cè)過程。諸多優(yōu)點(diǎn)使得這項(xiàng)技術(shù)不僅能夠滿足對(duì)檢測(cè)特異性、敏感性的要求，也能夠滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)和基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)大批量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否感染金黃色葡萄球菌進(jìn)行初步篩選的需要。

［1］方喜業(yè)，邢瑞昌，賀爭(zhēng)鳴.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制［M］.北京，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：371-372.

［2］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Ices，2000，28(12)：63.

［3］Eiken Chenieal Co.Ltd.The principles of LAMP method［EBIOL］.http://loopamp.eiken.eo.iP/e/tech/index.html.2003，10.

［4］嚴(yán)劍波，王虹玲，朱水榮，等.單增李斯特菌LAMP方法的建立［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(9)：2048-2050.

［5］周義正，王昌富，李向陽(yáng)，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的金黃色葡萄球菌［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19(9)：2075-2077.

［6］廖延雄.獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)診斷手冊(cè)［M］.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995，81-114.

［7］Brakstad OG， Aasbakk K， Maeland JA. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene［J］.J Clin Microbiol，1992，30(7)：1654-1660.