人載脂蛋白C3基因轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及血脂變化分析

全雄志，高 翔，張 旭，葛文萍，關(guān)菲菲，董 偉，張連峰，2

(1.衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

載脂蛋白C(apolipoprotein C，ApoC)是血漿中一組水溶性的低分子量蛋白質(zhì)，包括載脂蛋白C I、C II、C III和新近發(fā)現(xiàn)的C IV四個亞類，它們主要存在于乳糜微粒(chylom icron，CM)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)中。載脂蛋白C在脂蛋白代謝中發(fā)揮著重要的作用。載脂蛋白C III(ApoC III)是載脂蛋白 C族中含量最豐富的一類，通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)以及肝脂酶(hepatic lipase，HL)等酶和受體的活性來影響血漿富含甘油三酯脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotein，TRL)的代謝［1-2］。現(xiàn)在的研究證明，APOC3基因主要在肝臟和小腸中表達(dá)，但是在其他器官如肌肉、心臟、腎臟、脾臟等組織中也有一定量的表達(dá)［3-4］。所以，本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了系統(tǒng)性表達(dá)人載脂蛋白C3(APOC3)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，旨在為進(jìn)一步研究該基因與高血脂以及高血脂相關(guān)的心血管病提供工具動物。

1 材料和方法

1.1 人APOC3表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

基因購買自O(shè)rigene公司，用PCR的方法克隆該基因的開放閱讀框，并在兩端引入酶切位點(diǎn)Xho I (寶生物工程有限公司 中國)和 EcoR I(寶生物工程有限公司 中國)，插入pMD-18T simple vector(寶生物工程有限公司 中國)，測序結(jié)果無突變。以Xho I和EcoR I進(jìn)行酶切回收該基因片段，插入系統(tǒng)性表達(dá)啟動子Ubc下游構(gòu)建人APOC3轉(zhuǎn)基因載體。構(gòu)建成功后，再用Pvu II(寶生物工程有限公司中國)將其線形化，獲得Ubc啟動的人APOC3基因轉(zhuǎn)基因片段。調(diào)整濃度至5ng/μL，用顯微注射法(TE2000-U顯微注射儀)將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。C57BL/6J小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所康藍(lán)公司【SCXK-(京)2009-0007】，用ICR小鼠作假孕受體，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所康藍(lán)公司【SCXK-(京)2009-0007】。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為GC-09-2063。

1.2 PCR鑒定人 APOC3基因轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在9～14日齡時用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，利用特異引物通過 PCR法進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)條件：DNA模板10～100ng，上游引物為5'-TCCTTGTTGT TGCCCTCCT-3'，下游引物為5'-ACGGCTGAAGTTG GTCTGAC-3'(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，中國)。PCR反應(yīng)體系20μL(試劑購自寶生物工程有限公司，中國)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重復(fù)變性到延伸29次，完成30個循環(huán)。目的基因APOC3片段為274bp。

1.3 Western blot檢測鑒定APOC3基因的表達(dá)

提取人APOC3轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠血液、肝臟、肌肉、小腸、心臟、腎臟、脾臟總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上(Millipore美國)，置于5%脫脂奶粉封閉液，用山羊抗人APOC3抗體檢測基因的表達(dá)水平(Abcam)。采用辣根過氧化物酶(H rp)-耦聯(lián)的兔抗羊抗體結(jié)合一抗(Pierce，USA)，用Hrp-耦聯(lián)的鼠抗GAPDH單克隆抗體做為內(nèi)參(康成生物，中國)。

1.4 血生化分析檢測不同月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠的血脂指標(biāo)

分別選用3、5、7、9月齡的轉(zhuǎn)基因陽性小鼠6只(n=6)，和同齡野生型小鼠6只(n=6)，雌雄各半，眼眶靜脈取血，室溫靜置30min，4℃、5000r/min、離心15min，分離血清。用血生化分析儀(日立7020日本)分析小鼠血脂指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS 11.5軟件進(jìn)行組間差異的比較，采用的是獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(independent-sample t test)。

1.5 脂肪染色觀察5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠的肝臟脂肪水平

選用5月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同齡野生小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開腹腔取出肝臟，將肝臟組織固定在4%中性甲醛中48h，進(jìn)行修塊、脫水、包埋、切片、油紅O染色和鏡下觀察(Nikon顯微鏡，日本和Leica MZ16F體視鏡，德國)。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

用PCR克隆的人APOC3基因，測序結(jié)果表明同已報(bào)道的人APOC3序列完全一致(Gene ID：345，NM-000040)。將該基因插入系統(tǒng)性表達(dá)啟動子Ubc下游，構(gòu)建人APOC3基因轉(zhuǎn)基因載體(圖1)。

圖1 APOC3基因轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體Fig.1 APOC3transgenic construct

2.2 APOC3轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9～14d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增APOC3目的基因274bp的片段來檢測APOC3轉(zhuǎn)基因小鼠(圖2)，共得到6只首建鼠均可傳代。

圖2 PCR鑒定APOC3轉(zhuǎn)基因小鼠基因型注：P：陽性對照；N：陰性對照；W：空白對照；M：DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)記；1、2、5、9、11、12是F0代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；3、4、6、7、8、10、13、14是F0代陰性小鼠。Fig.2 Genotyping of the APOC3transgenic m ice by PCRNote：P is positive control；N is negative control；W is blank control；M is DNA molecular weight marker；Lane 1，2，5，9，11，12are positive transgenic mice；Lane 3，4，6，7，8，10，13，14are F0negative mice.

2.3 APOC3基因的表達(dá)

首先用Western blot分析6個系1月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠血液中 APOC3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示APOC3在血液中均有表達(dá)(圖3A)，選取表達(dá)高的一個系保種繁殖，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。繼續(xù)用Western blot分析選出的高表達(dá)系的3、5、7、9月齡APOC3轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠血液中APOC3的表達(dá)情況，其中 5月齡表達(dá)量最高(圖3B)。因此，進(jìn)一步分析5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠全身多種組織的總蛋白中APOC3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示APOC3基因肝臟、小腸、肌肉、心臟、腎臟、脾臟中皆有高表達(dá)(圖3C)。

2.4 不同月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠的血脂指標(biāo)

3，5，7，9月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠的血脂指標(biāo)分析顯示，3、5、7、9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠甘油三酯(triglyceride，TG)分別比同齡野生小鼠高20.7%(P＜0.01)、212.5%(P＜0.01)、41.2%(P＜0.01)、28.6%(P＜0.01)(圖4)。

2.5 肝臟脂肪水平

用5月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同齡野生小鼠肝臟組織進(jìn)行油紅O染色，鏡下觀察顯示，脂肪顆粒呈橘紅色，呈片狀分布于肝臟組織內(nèi)，血管周圍居多，轉(zhuǎn)基因陽性小鼠與同齡野生小鼠相比，脂肪顆粒明顯增多(圖5)。

3 討論

近年來，心血管疾病的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，已成為老年人的主要死亡原因之一，同時，血脂代謝紊亂在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用已得到大家的公認(rèn)。ApoC III作為機(jī)體內(nèi)TRL分解代謝的主要調(diào)節(jié)因子之一，大宗的臨床試驗(yàn)證實(shí)，作為冠狀動脈疾病發(fā)生的預(yù)警信號，ApoC III比傳統(tǒng)意義上的血漿TG水平更有價(jià)值［5-10］。

圖3 APOC3基因在轉(zhuǎn)基因小鼠血液、肝臟、小腸、肌肉、心臟、腎臟、脾臟中的表達(dá)注：WT：野生型小鼠；1、2、5、9、11、12：轉(zhuǎn)基因小鼠；內(nèi)參：GAPDH。Fig.3 Expression of APOC3in the blood，liver，intestine，muscle，heart，kidney and spleen of the transgenic mice Note：WT：Wild type mice；1，2，5，9，11，12：Transgenic mice；The Western blot is normalized with GAPDH.

圖4 不同月齡小鼠血漿甘油三酯含量注：野生組與轉(zhuǎn)基因組相比較，*P＜0.01Fig.4 Triglyceride of the mice at different agesNote：W ild type compared with the transgenic mice，*P＜0.01

動物實(shí)驗(yàn)及人體實(shí)驗(yàn)均表明，ApoC III在體內(nèi)富含甘油三酯脂蛋白(TRL)的分解代謝中具有重要的調(diào)節(jié)作用，它是脂蛋白脂酶(LPL)的抑制劑，同時還可以抑制肝臟對TRL及其殘粒的攝取。脂蛋白脂酶(LPL)能催化 CM及 VLDL中甘油三酯的代謝，在血管內(nèi)皮表面發(fā)揮作用，是TRL分解代謝的關(guān)鍵酶。ApoC III是脂蛋白脂酶最強(qiáng)的抑制劑之一［11］。國外學(xué)者研究證實(shí)，加 ApoC III到 ApoC III缺乏癥患者血清中可以降低20% ～50%的脂蛋白脂酶活性［12］。ApoC III能抑制肝臟攝取 CM、VLDL以及其殘粒，使血液中TG含量增加，引起高甘油三酯血癥。W ind ler等［13］以灌流大鼠肝臟為模型的研究發(fā)現(xiàn)，將人或大鼠 ApoC III加入到含有乳糜微?；騐LDL的肝灌流液中，可顯著減少肝臟對CM及VLDL的攝取。大量的動物及人體研究均表明，ApoC III是通過影響肝細(xì)胞膜上脂蛋白受體的識別功能而影響肝臟對TRL及其殘粒的代謝的。Maeda等［14］在動物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)人ApoC III基因小鼠中，當(dāng)血漿ApoC III水平增加40%，血漿TG即增加2倍。

本研究經(jīng)過Western blot篩選，得到了高表達(dá)人APOC3基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。通過對不同月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠血生化分析結(jié)果的比較，以及肝臟脂肪染色觀察，證明該轉(zhuǎn)基因品系具有高脂血癥的表型，可以作為研究脂蛋白代謝紊亂、高脂血癥、脂肪肝、動脈粥樣硬化等疾病的實(shí)驗(yàn)動物模型［15］。

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圖5 肝臟脂肪染色A：野生型小鼠肝臟；B：轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟；C：野生型小鼠肝臟；D：轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟；注：箭頭所示為肝臟脂肪顆粒。Fig.5 Distribution of fat in the mouse livers.Fat stainingA：The liver of a wild type mouse；B：The liver of a transgenic mouse；C：The liver of a wild type mouse；D：The liver of a transgenic mouse；Note：Arrows show the fat particles.