HPLC法測(cè)定注射用阿洛西林鈉樣品中氨芐西林的含量

顧 珉

（蘇州市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州 215002）

阿洛西林（Azlocillin）是第三代廣譜半合成青霉素，對(duì)G+菌、G-菌及厭氧菌有效，能強(qiáng)烈地對(duì)抗綠膿桿菌，適用于G+菌、G-菌及厭氧菌引起的感染，包括敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、化膿性腦膜炎、腹膜炎及下呼吸道、胃腸道、膽道、泌尿道、骨及軟組織、生殖器官、皮膚燒傷等疾病[1]。20世紀(jì)80年代以來，先后在英國(guó)、美國(guó)、日本、意大利、荷蘭、瑞士等獲得臨床應(yīng)用，本品耐受性好，不良反應(yīng)發(fā)生率低，且多輕微，類似青霉素的不良反應(yīng)，在國(guó)內(nèi)的青霉素類藥品應(yīng)用中有一定的市場(chǎng)占有率[2]。注射用阿洛西林鈉原收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第48冊(cè)WS1-（X-002）-2004Z，該標(biāo)準(zhǔn)在有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)中分別對(duì)雜質(zhì)總量和單個(gè)最大雜質(zhì)的量進(jìn)行控制；目前該品種已收載入《中國(guó)藥典》2010年版二部[3]，提高了有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下雜質(zhì)總量和單個(gè)最大雜質(zhì)的量的限度規(guī)定，但方法均基于自身稀釋對(duì)照法，而未見有對(duì)阿洛西林鈉注射劑中相關(guān)雜質(zhì)成分的含量測(cè)定方法的報(bào)道。阿洛西林鈉在結(jié)構(gòu)上可看做氨芐西林的衍生物[4]，阿洛西林鈉原料藥大都以氨芐西林三水酸為起始原料，經(jīng)與側(cè)鏈1-氯甲?；?2-咪唑烷酮縮合得阿洛西林酸，成鈉鹽后，真空冷凍干燥制得阿洛西林鈉。而市售的注射用阿洛西林鈉大部分采用無(wú)菌原料藥分裝的生產(chǎn)工藝，因此企業(yè)在原料藥質(zhì)量控制上未把好關(guān)，可能會(huì)在最終產(chǎn)品造成樣品中氨芐西林的量過高，影響最終樣品的純度。而注射用阿洛西林鈉的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于樣品中的雜質(zhì)氨芐西林無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量控制，因此本文提出了注射用阿洛西林鈉中氨芐西林含量測(cè)定的高效液相色譜方法。該方法的建立為進(jìn)一步完善注射用阿洛西林鈉的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系、優(yōu)化其生產(chǎn)工藝提供參考。

1 儀器與試藥

儀器：SHIMADZU LC-20高效液相色譜儀（日本島津公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Melttler公司）。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。氨芐西林對(duì)照品（批號(hào)130410-200706，含量85.7%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），阿洛西林對(duì)照品（批號(hào)130566-200601，含量93.7%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。注射用阿洛西林鈉（瑞陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)10091913，11021014，10122112，11010513，11011511；蘇州二葉制藥有限公司，批號(hào)100804，101208，101204，101206，100904；浙江金華康恩貝有限公司，批號(hào)DB1005018-2，DC1012005-4，DA1007004-3，DC1102013-6，DC1102004-5）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

取氨芐西林對(duì)照品（中檢所，批號(hào)130410-200706，含量85.7%）加流動(dòng)相制成每1mL中約含1000μg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取注射用阿洛西林鈉樣品，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含阿洛西林0.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

圖1 對(duì)照品及樣品色譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：Kromasil 100A C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（取無(wú)水磷酸氫二鉀4.09g和磷酸二氫鉀，加水溶解并稀釋至1000mL）-乙腈（85∶15）；流速為每分鐘1.0mL，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量20μL。分別精密吸取氨芐西林和阿洛西林對(duì)照品溶液、空白對(duì)照（流動(dòng)相）和供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。理論板數(shù)以氨芐西林峰計(jì)算均＞9000，氨芐西林和阿洛西林的分離度均＞15.0，且流動(dòng)相對(duì)氨芐西林檢出無(wú)干擾。

2.3 線性關(guān)系

取氨芐西林對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，將其分別稀釋0.5、0.2、0.1、0.02、0.01、0.005倍。分別進(jìn)樣20μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y=51042x+213583，r2=0.9997，線性范圍0.0954~19.0802μg。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取0.5倍對(duì)照品溶液20μL，平行進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算色譜系統(tǒng)精密度，氨芐西林峰面積RSD值為0.168%（n=5）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取注射用阿洛西林鈉樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別在1，2，4，8，16，24h進(jìn)樣，每次20μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果氨芐西林峰面積的RSD值為1.95%，表明氨芐西林在樣品溶液條件下保持穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取”2.5”項(xiàng)下同一批注射用阿洛西林鈉樣品9份，每一份約50mg，精密稱定，置100mL容量瓶中。將9份樣品平均分成3組，每組樣品分別精密加入1000μg/mL、200μg/mL、100μg/mL的氨芐西林對(duì)照品溶液各5mL，按“2.1”項(xiàng)下溶解樣品，并按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果氨芐西林的平均加樣回收率為97.8%，RSD為1.7%。

2.7 樣品中氨芐西林含量測(cè)定結(jié)果

取市售的的3個(gè)廠家的注射用阿洛西林鈉各5個(gè)批號(hào)樣品，每批樣品取3份，每份樣品取約50mg，精密稱定，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取制備的樣品溶液各20μL進(jìn)樣，依法測(cè)定，根據(jù)氨芐西林峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算注射用阿洛西林鈉樣品中氨芐西林的平均含量，并按照《中國(guó)藥典》2010年版二部注射用阿洛西林鈉有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下方法計(jì)算氨芐西林含量，各批次樣品結(jié)果見表1。

表1 注射用阿洛西林鈉中氨芐西林含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

由表1數(shù)據(jù)，我們可以看到某廠家部分批號(hào)樣品檢出氨芐西林含量比較高，如10091913和11021014批樣品檢出氨芐西林含量在0.5%以上，另有10122112和11011511批樣品未檢出氨芐西林，表明不同批次樣品的氨芐西林含量有差異，該企業(yè)應(yīng)更加關(guān)注不同批次的原料藥質(zhì)量的差異性，找出造成質(zhì)量差異的工藝或處方原因，以達(dá)到不同批次的最終產(chǎn)品質(zhì)量的可控性；某廠家的100804，101208，101204，101206，100904等5批樣品檢出氨芐西林的量均在0.5%附近，相比另一個(gè)廠家的樣品氨芐西林檢出量均處于高位數(shù)值，原料藥質(zhì)量還有很大的提高余地。

目前中國(guó)藥典對(duì)注射用阿洛西林鈉中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法采用樣品的自身稀釋對(duì)照法，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了對(duì)注射用阿洛西林鈉樣品中單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量的控制，然而該方法假定樣品中的雜質(zhì)與主成分阿洛西林有相同的色譜響應(yīng)比（響應(yīng)峰面積/成分質(zhì)量濃度），造成了對(duì)特定雜質(zhì)氨芐西林的控制結(jié)果就不一定準(zhǔn)確，通過對(duì)氨芐西林的含量測(cè)定結(jié)果與按《中國(guó)藥典》注射用阿洛西林鈉有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的量與二者的相關(guān)性都很低（Pearson系數(shù)分別為0.006和0.353）。如果只控制有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量這兩項(xiàng)指標(biāo)，就會(huì)給我們企業(yè)在樣品或原料藥的質(zhì)量監(jiān)控方面帶來誤導(dǎo)，因此建議有關(guān)部門在制定注射用阿洛西林鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)考慮對(duì)特定雜質(zhì)氨芐西林進(jìn)行控制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的方法能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定注射用阿洛西林鈉中氨芐西林的含量，對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)可以作為該制劑的一個(gè)質(zhì)量控制的參考標(biāo)準(zhǔn)。

[1]王繼紅.阿洛西林鈉臨床應(yīng)用情況[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,18(13):1571.

[2]錢元恕,王其南.阿洛西林的抗菌作用及臨床藥理[J].中國(guó)抗生素雜質(zhì),1990,15(6):463-472.

[3]中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典:二部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:400-401.

[4]陸潤(rùn)鐘.抗假單孢菌的半合成青霉素:阿洛西林[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),1989,10(2):105-111.