HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定知母藥材中4種主要皂苷的含量

尹 茶，吳婷婷，朱東亮，劉職瑞，柴逸峰(.第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，上海004;.解放軍6醫(yī)院藥械科，北京049;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，上海004)

知母為百合科知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，具有清熱瀉火、生津潤(rùn)燥的功能。臨床用于外感風(fēng)寒，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明知母中的甾體皂苷具有多種的藥理活性，包括:抑制血小板的聚集［2］、清除自由基［3］、降血脂［4］，抗腫瘤［5］，抑制Na+-K+-ATP酶［6］以及改善認(rèn)知功能、提高學(xué)習(xí)記憶能力［7］等作用。知母中所含甾體皂苷種類較多，水解后的苷元主要是菝葜皂苷元(sarsasapogenin)，2000年及以前藥典以菝葜皂苷元含量作為指標(biāo)，反映總皂苷的含量。此法雖可作為知母藥材基本的質(zhì)量控制方法，但是僅能間接反映總皂苷的含量。而且水解的過(guò)程改變了藥材中成分的原有組成，操作也相對(duì)繁瑣。因此直接測(cè)定藥材中主要皂苷的含量應(yīng)該更能反映藥材的質(zhì)量狀況。知母藥材中皂苷的含量測(cè)定已有一些報(bào)道［8～10］，包括單獨(dú)測(cè)定知母BⅡ和同時(shí)測(cè)定幾種知母皂苷，但測(cè)定時(shí)間都較長(zhǎng)。此外同時(shí)對(duì)中藥中多成分的測(cè)定，還要保證方法的快速、簡(jiǎn)便、廣泛，從而提高方法的適用性和實(shí)用性。因此本文建立了同時(shí)測(cè)定知母藥材中知母皂苷B、知母皂苷E1、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的HPLC-ELSD方法，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，且具有足夠的靈敏度，可為知母藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

WATERS 510型雙泵;996 PDA檢測(cè)器;Rheodyne 7725i進(jìn)樣器;法國(guó)SEDEX 75型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD);柱后連接PDA，再與ELSD采用串連方法連接;WATERS Empower pro色譜工作站; SrA3dv色譜數(shù)據(jù)工作站;ORION MODEL 828型pH計(jì);METTLER AE240電子天平;BRANSON SB3200-T型超聲儀。

知母生藥材均由本校生藥教研室陳萬(wàn)生教授采集鑒定為百合科知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。并按照《中國(guó)藥典》2010版一部規(guī)定進(jìn)行干燥，切片，粉碎，過(guò)40目篩，60℃干燥至恒定質(zhì)量等預(yù)處理。知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII對(duì)照品由本校生藥教研室制備;乙腈為色譜純(Fisher公司)，冰醋酸為分析純(上海精細(xì)科技研究所)，水為去離子水，其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Zorbax SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm，Agilent);流動(dòng)相:A相為水(冰醋酸調(diào)節(jié)pH 3.3)，B相為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～8 min，12%～23%B;8～25 min，23%B; 25～35 min，23%～45%B;35～40 min，45%～95% B;流速:1.0 ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量10 μl。進(jìn)樣前以流動(dòng)相初始梯度平衡10 min。檢測(cè)器漂移管溫度55℃，蒸發(fā)溫度70℃，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器以氮?dú)鉃殪F化氣，壓力為4.0 Bar。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取知母皂苷B、知母皂苷 BII、知母皂苷 E1對(duì)照品4.21、19.22、4.88 mg，以70%乙腈溶解，定容于10 ml量瓶中，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。另精密稱取知母皂苷AIII對(duì)照品5.32 mg，以70% 乙腈溶解，定容于25 ml量瓶中，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 樣品溶液的制備 取知母藥材粉末0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，稱重，加入50 ml 80%甲醇，超聲45 min，以80%甲醇補(bǔ)足重量后濾紙直接過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 在2.1項(xiàng)的色譜條件下，以對(duì)照品溶液和樣品進(jìn)樣，根據(jù)色譜參數(shù)計(jì)算系統(tǒng)適應(yīng)性。理論塔板數(shù)以知母皂苷E1計(jì)算大于14 000;以知母皂苷BII計(jì)算大于15 000;以知母皂苷B計(jì)算大于25 000;以知母皂苷AIII計(jì)算大于60 000;待測(cè)物峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，符合含量測(cè)定要求。對(duì)照品及樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)和樣品(B)溶液的HPLC-ELSD色譜圖1-知母皂苷B;2-知母皂苷E1;3-知母皂苷BII;4-知母皂苷AIII

2.3.2 線性關(guān)系 精密吸取對(duì)照品混合溶液逐級(jí)用70%乙腈減半稀釋，得5個(gè)濃度梯度的對(duì)照品混合溶液(知母皂苷 B依次為:42.10、84.20、168.4、210.5、252.6 μg/ml，知母皂苷E1依次為:49.80、 97.60、195.2、244.0、292.8 μg/ml，知母皂苷BII依次為:192.2、384.4、768.8、961.0、1 153 μg/ml，知母皂苷AIII依次為8.512、17.02、34.05、42.56、85.12 μg/ml。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程知母皂苷B在42.10～252.6 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y=1.507 6X+2.995 5(r=0.999 3);知母皂苷E1在48.80～292.8 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y= 1.494 6X+2.593 3(r=0.999 1);知母皂苷BII在192.2～1 153 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y=1.329 0X +2.957 4(r=0.999 7);知母皂苷A III在8.512～85.12 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程Y=1.381 7X+ 3.662 2(r=0.998 5)。

2.3.3 精密度 在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別以對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII峰面積積分值RSD分別為0.35%、0.29%、0.79%、0.46%，符合含量測(cè)定要求。

2.3.4 穩(wěn)定性 精密稱取產(chǎn)地為山東濟(jì)南的知母藥材粉末0.8 g，照2.2.2項(xiàng)下的方法制備樣品溶液。分別在0、3、6、12、18、24、26、48 h測(cè)定4種有效成分的峰面積，計(jì)算其RSD，結(jié)果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII峰面積積分值RSD分別為0.56%、0.81%、0.71%、0.91%，符合含量測(cè)定要求。

2.3.5 重復(fù)性 精密稱取批號(hào)為H2011080502的知母藥材粉末5份各約0.8 g，按照2.2.2項(xiàng)方法制備樣品溶液，測(cè)定4種有效成分的含量，計(jì)算其RSD。結(jié)果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷 AIII含量的 RSD分別為 0.56%、0.81%、0.71%、0.91%，符合含量測(cè)定要求。

2.3.6 最低檢測(cè)限 經(jīng)一系列稀溶液測(cè)定，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷B和知母皂苷AIII的最低檢測(cè)限分別為4.9、5.5、6.2、3.7 μg/ml。

2.3.7 加樣回收率 取批號(hào)為H2011080502的知母藥材粉末約0.8 g，精密稱定，其中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷B和知母皂苷AIII含量分別是7.079 6、50.981 5、6.064 9、0.827 7 mg/g，分別精密加入適量的對(duì)照品溶液，分別按2.2.2項(xiàng)方法制備樣品溶液，測(cè)定4種有效成分的含量，結(jié)果其平均加樣回收率為102.8%、96.04%、97.27%、98.15%;其RSD分別為1.11%、0.46%、1.06%、3.24%，結(jié)果表明此方法的準(zhǔn)確性良好，符合含量測(cè)定的要求。

2.4 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地知母藥材，分別按2.2.2項(xiàng)方法制備樣品溶液，測(cè)定4種皂苷成分的含量，每份供試品溶液重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值作為各產(chǎn)地藥材的成分含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地知母藥材中知母皂苷含量(，n=3，mg/g)

表1 不同產(chǎn)地知母藥材中知母皂苷含量(，n=3，mg/g)

AIII H2011073101 河北易縣 1.435±0.063 9.754±0.033 63.02±0.082 0.6578批號(hào) 產(chǎn)地 知母皂苷B 知母皂苷E1 知母皂苷BII 知母皂苷±0.0035 H2011080502 河北易縣 2.392±0.087 15.55±0.071 63.05±0.131 2.053±0.009 H2011081904 河北赤城 1.160±0.077 11.15±0.083 56.52±0.074 0.7754±0.0018 H2011100901 河北赤城 3.897±0.034 9.679±0.054 56.82±0.129 0.8525±0.0021 H2011010903 河北陽(yáng)原 6.346±0.036 9.292±0.017 67.31±0.051 0.4633±0.0019 H2010081601 河北陽(yáng)原 4.265±0.025 10.57±0.080 58.47±0.110 0.9916±0.0033 A2009080303 安徽亳州 15.68±0.031 7.226±0.076 39.09±0.033 1.541±0.005 H2012030609 湖南長(zhǎng)沙 4.223±0.032 7.753±0.045 49.78±0.175 2.186±0.007 L2012010402 遼寧丹東 4.981±0.044 8.052±0.039 54.55±0.117 1.263±0.008 S2011080901 山東濟(jì)南 5.144±0.029 7.080±0.041 52.15±0.194 2.721±0.013 S2011060703 山東青島 6.065±0.018 7.770±0.029 50.98±0.096 0.8277±0.0041 Z2011051201 浙江溫州 8.721±0.064 7.873±0.013 48.16±0.141 1.100±0.006 H2012031801 河南新鄉(xiāng) 7.042±0.085 8.169±0.037 43.05±0.071 1.356±0.012

3 討論

3.1 樣品前處理方法優(yōu)化 對(duì)知母藥材樣品溶液的制備，有文獻(xiàn)報(bào)道［10］，采用80%乙醇提取效果最好，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同提取方法(超聲、回流、索氏提取)、不同提取溶劑(100%甲醇、80%甲醇、80%乙醇)對(duì)知母藥材的提取效果，結(jié)果采用索氏提取與回流的效果相差不大，超聲的提取效率顯著高于前兩者，且采用80%甲醇超聲的提取效果較80%乙醇和100%甲醇要好得多。綜合經(jīng)濟(jì)實(shí)用、快捷簡(jiǎn)便等各個(gè)方面，故確定最終的提取條件采用80%甲醇50 ml，超聲處理45 min。這樣既可把其中有效成分盡可能多的提取出來(lái)，又可節(jié)約時(shí)間，方便操作。

3.2 色譜條件優(yōu)化 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別使用甲醇－水系統(tǒng)以及乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)獲得的總的分離度大于甲醇-水系統(tǒng)，故選擇乙腈-水系統(tǒng)作為基礎(chǔ)的流動(dòng)相，同時(shí)發(fā)現(xiàn)降低流動(dòng)相的pH值有助于改善色譜峰峰型及優(yōu)化分離，故向流動(dòng)相中加入一定比例的冰醋酸。知母皂苷B、E1、BII為呋甾皂苷，知母皂苷AⅢ為螺甾皂苷，兩類皂苷極性相差較大，用等度洗脫無(wú)法同時(shí)保證4種皂苷的合適保留時(shí)間和較好的分離。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，采用水(醋酸調(diào)至pH 3.3)和乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，使極性較大的呋甾皂苷不致出峰過(guò)早，極性較小的螺甾皂苷也不會(huì)因保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而峰形展寬，4個(gè)成分均能夠分離良好，保障了測(cè)定的準(zhǔn)確性。

3.3 ELSD工作參數(shù)的確定 在ELSD實(shí)驗(yàn)中，為了獲得更高的靈敏度，需要調(diào)節(jié)載氣壓力和漂移管溫度這2個(gè)最關(guān)鍵的儀器參數(shù)。它們的通用參數(shù)為載氣壓力(3.5 Bar)和漂移管溫度(40℃)，但在本梯度條件下，由于實(shí)驗(yàn)采用了乙腈-水系統(tǒng)，初始梯度含有高比例的水，色譜圖中會(huì)由于溶劑的揮發(fā)不完全而導(dǎo)致毛刺峰的產(chǎn)生，通過(guò)對(duì)儀器的通用參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，逐漸提高載氣壓力，當(dāng)載氣壓力到達(dá)至4.0 Bar時(shí)，色譜圖中的毛刺峰基本消失，再增加載氣壓力，不能得到更優(yōu)化的結(jié)果，在此載氣條件下逐漸調(diào)節(jié)漂移管溫度，當(dāng)溫度逐漸上升時(shí)，色譜圖中毛刺峰也有一定的優(yōu)化，當(dāng)設(shè)為55℃后，基本達(dá)到最佳。故最終確定的ELSD檢測(cè)參數(shù):漂移管溫度55℃;載氣壓力4.0 Bar。另外，設(shè)定增益值為7，可以使信號(hào)相應(yīng)較高，且基線的噪音不會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生任何影響。特別值得注意的是，由于ELSD獨(dú)特的散射光檢測(cè)原理，物質(zhì)的響應(yīng)與濃度不成線性關(guān)系，而是對(duì)數(shù)關(guān)系，在制定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，對(duì)峰面積以及樣品濃度均采用雙對(duì)數(shù)進(jìn)行運(yùn)算，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線也不會(huì)經(jīng)過(guò)原點(diǎn)，在進(jìn)行樣品含量測(cè)定時(shí)，也采用同樣的計(jì)算方式。

3.4 藥材之間的質(zhì)量差異 對(duì)13個(gè)不同產(chǎn)地(批號(hào))的知母藥材測(cè)定結(jié)果表明，與文獻(xiàn)中知母皂苷含量在6%左右的結(jié)果相符，但藥材中所含的4種皂苷，其含量間的差異較大，其中以知母皂苷B的含量差異最大，安徽亳州產(chǎn)地的(A2009080303)與河北赤城產(chǎn)地的(H2011081904)相差高達(dá)13.52倍，其他成分的含量最大與最小含量之間差異在1.62～5.87倍不等。雖然單個(gè)成分的差異較大，但藥材中總皂苷的含量差別相對(duì)較小，僅為1.37倍，充分說(shuō)明在藥材種植過(guò)程中，由于影響藥材生長(zhǎng)的諸多因素等的作用，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生不同變化，也證明需要具體分析藥材中的活性成分的含量，而一般僅僅水解皂苷，分析菝葜皂苷元的做法或者僅僅測(cè)定其中的紫外吸收部位對(duì)知母的質(zhì)量控制是不完全的，本文建立的色譜方法能夠?qū)χ杆幉淖鞲訃?yán)格的質(zhì)量控制，從而能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究知母活性成分的藥理藥效提供基礎(chǔ)。

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