三七總皂苷對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖模型細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

黃小平，陳 剛，鄧常清*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

三七總皂苷對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖模型細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

黃小平，陳 剛，鄧常清*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 研究三七總皂苷(TPNS)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法以血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）誘導(dǎo)大鼠VSMC，觀察含藥血漿對(duì)VSMC增殖的影響，以免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）剌激VSMC后，VSMC PCNA、VSMC細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）蛋白表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞周期抑制因子P21蛋白表達(dá)下調(diào)。阿托伐他汀含藥血漿和TPNS含藥血漿均可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC PCNA、cyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)增強(qiáng)及P21蛋白表達(dá)下調(diào)。TPNS與阿托伐他汀比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 PDGF剌激VSMC后，可促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖加快。阿托伐他汀、TPNS可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖，其作用可能是通過抑制了細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，從而抑制了VSMC細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化和增殖。

三七總皂苷；血管平滑肌細(xì)胞；大鼠；增殖細(xì)胞核抗原；細(xì)胞周期蛋白D1；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4

三七總皂苷（Total Panax Notoginseng Saponin，TPNS）是從中藥五加科植物三七panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen干燥根中提取的皂苷類有效組分，其主要有效成分為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1等。Lin等[1]的研究表明，TPNS可顯著抑制高脂血清對(duì)VSMC的促增殖作用。研究表明，在大鼠主動(dòng)脈球囊損傷血管內(nèi)膜增生模型，TPNS可抑制血管內(nèi)膜增生，抑制VSMC過度增殖，具有抗血管再狹窄的作用[2-3]。但TPNS抗血管再狹窄的機(jī)制還不清楚。由于VSMC在血管增殖性病變中具有重要的地位，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，本研究采用血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）誘導(dǎo)的VSMC增殖模型，研究TPNS抗VSMC增殖的作用及其細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠由湖南省衛(wèi)生防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。體質(zhì)量120～150 g，雌雄各半。合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第20-010號(hào)。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18～20℃，濕度65%～70%，自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 藥物 TPNS購(gòu)自廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，批號(hào):071119。TPNS系從三七（panax notoginsen）中提取的皂苷類活性成分[3]。以高效液相色譜法測(cè)定TPNS主要有效成分的含量[3]，含人參皂苷Rg150.4%，人參皂苷Rb130.9%，三七皂苷R112.5%。阿托伐他汀（atorvastatin），規(guī)格 10 mg/片，Godecke GmbH生產(chǎn)，輝瑞制藥有限公司分裝，批號(hào):080117。臨用時(shí)以去離子蒸餾水配成2 mg/mL混懸液。

1.1.3 試劑 杜爾伯科改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基、胰蛋白酶(1∶250)購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；DMEM培養(yǎng)基以超純水配制，過濾除菌，-20℃保存；胎牛血清(FCS)購(gòu)自杭州四季青試劑公司，56℃滅活補(bǔ)體30 min，過濾除菌后分裝，-20℃保存。血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）、碘化丙啶（Propidium iodide，PI)、二甲基亞砜（DMSO）等均購(gòu)自 Sigma 公司；其余試劑均為分析純。抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 抗體和抗 p21蛋白抗體，為小鼠抗大鼠單克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司；抗CDK4抗體和抗β-actin抗體為小鼠抗大鼠多克隆抗體，購(gòu)自北京博奧森生物試劑公司；第二抗體異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗小鼠抗體用于 PCNA、cyclinD1、P21、CDK4 的測(cè)定，第二抗體HRP標(biāo)記的兔抗小鼠抗體用于β-actin的測(cè)定。以上二抗均購(gòu)自Amersham公司。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（產(chǎn)地：美國(guó),型號(hào)：SHEL-LAB2300）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)產(chǎn)，型號(hào)：FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 原代細(xì)胞培養(yǎng)：采用組織貼塊法培養(yǎng)[4]。傳代培養(yǎng)取原代生長(zhǎng)的 VSMC，以 Hank’s液洗滌后，以 0.25%胰蛋白酶消化，以 FCS終止反應(yīng)，DMEM 培養(yǎng)基洗滌后，以含20%FCS的DMEM培養(yǎng)基制成1×106/mL細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞鑒定:倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的VSMC貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，放射性生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)透明，相互融合在一起。成束的細(xì)胞平行排列，呈鋪路石樣“峰-谷”狀生長(zhǎng)。用免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定VSMC的SMα-actin表達(dá)，可見到VSMC胞漿中SMα-actin呈陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)用VSMC 4-6代傳代細(xì)胞。

1.2.2 含藥血漿的制備 按文獻(xiàn)方法[5]，將大鼠隨機(jī)分為空白組、TPNS（200 mg/kg）組和阿托伐他汀（20 mg/kg）組。每組10～12只?？瞻捉M灌胃等量蒸餾水（給藥體積為10 mL/kg），各給藥組分別灌胃藥物。每天給藥2次，分別在上午9時(shí)和下午4時(shí)。連續(xù)灌胃7次后，于末次給藥2 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸總動(dòng)脈取血，以1.5%乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2 抗凝（血液∶抗凝劑=9∶1），在 4 ℃3 000 r/min離心15 min，取血漿，將各給藥組各鼠血漿等量混合即為含藥血漿，空白組各鼠血漿等量混合即為空白血漿，除菌后分裝，-70℃保存。

1.2.3 VSMC細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定 根據(jù)以往研究[6]，空白血漿濃度為10%，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，對(duì)VSMC增殖的抑制率為8%，TPNS含藥血漿和阿托伐他汀含藥血漿對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）均為（13±3）%，故設(shè)定空白血漿和含藥血漿的終濃度均為10%。將培養(yǎng)細(xì)胞分為無血漿空白對(duì)照組、PDGF刺激組、空白血漿組、TPNS含藥血漿組、阿托伐他汀含藥血漿組，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化于G0期，然后分別加入各含藥血漿（終濃度10%），3 h后加入PDGF-BB（終濃度 10 ng/mL），培養(yǎng) 24 h后測(cè)定。運(yùn)用免疫熒光流式細(xì)胞分析術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、P21和增殖相關(guān)蛋白 PCNA的表達(dá)。 取 1×106／mL細(xì)胞懸液 1mL， 加入 80%乙醇1 mL-20℃放置2 h，用PBS液洗滌后加入0.25%Triton X-100冰浴5 min， 樣品管加一抗（1∶100）20 μL，避光4℃過夜，PBS洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶40），37℃避光30 min后加入含PI（10 g/L）和0.1%核糖核酸酶A的PBS緩沖液 1 mL避光37℃ 30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為506 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為526 nm，以平均熒光強(qiáng)度值（MFI）反映所測(cè)蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)比較的柱狀圖（，n=5）

2 結(jié)果

與無血漿空白組比較，PDGF刺激組CyclinD1、CDK4、PCNA 蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.01），P21 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）?？瞻籽獫{組CyclinD1、CDK4、PCNA表達(dá)均顯著高于無血漿空白組（P<0.01），但表達(dá)均低于 PDGF 刺激組（P<0.05）；空白血漿組P21表達(dá)也顯著低于無血漿空白組（P<0.01），但略高于 PDGF 刺激組（P<0.05）。 TPNS含藥血漿組和阿托伐他汀含藥血漿組與空白血漿組比較，CyclinD1、CDK4、PCNA 表達(dá)均顯著降低（P<0.01），P21 表達(dá)均顯著增高（P<0.01）。但各含藥血漿組與無血漿空白組比較，CyclinD1、CDK4、PCNA 表達(dá)均升高（P<0.05），P21 表達(dá)降低（P<0.05）。 而兩個(gè)含藥血漿組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P>0.05）。見圖 1。

3 討論

VSMC的異常增殖是血管增殖性疾病發(fā)生的重要因素。已有研究表明，血管緊張素受體拮抗劑、降血脂藥羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑等可對(duì)抗VSMC增殖，延緩血管增生性病變的發(fā)生[7-8]。進(jìn)一步開展中藥及其有效成分抗血管再狹窄的研究，從中尋找確有效應(yīng)的中藥及其成分，這對(duì)于提高血管增殖性病變防治的療效具有重要的意

生長(zhǎng)因子作用于VSMC膜受體，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致核內(nèi)基因表達(dá)，從而調(diào)控VSMC的增殖。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等為刺激VSMC增殖的主要生長(zhǎng)因子。PDGF家族成員有PDGF-A、B、C、D。 PDGF-BB 能刺激多種細(xì)胞如VSMC、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的分裂增生，促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞分裂、增殖[9]，常作為促VSMC增殖的生長(zhǎng)因子使用。故在本研究中，以PDGF-BB刺激VSMC增殖為本研究的模型。

PCNA是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的參與DNA合成的核蛋白，僅能在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)，是S期的特異性標(biāo)記，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖程度成正比[10]。本研究表明，PDGF剌激后，PCNA表達(dá)增強(qiáng)。表明在PDGF剌激后，VSMC增殖增快。與PDGF剌激組比較，空白血漿可使PCNA表達(dá)降低，這可能是血漿中含有的抗凝劑EDTA-Na2對(duì)細(xì)胞的影響所致。陽性對(duì)照藥阿托伐他汀含藥血漿和TPNS含藥血漿均可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC PCNA表達(dá)，表明二者對(duì)PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖具有抑制作用。

細(xì)胞增殖取決于細(xì)胞在細(xì)胞外信號(hào)的作用下，細(xì)胞周期的有序進(jìn)展。細(xì)胞周期主要依次由G1、S、G2和M 4個(gè)期組成。其存在兩個(gè)限制點(diǎn)，決定細(xì)胞是否繼續(xù)增殖或進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài):一個(gè)限制點(diǎn)在DNA合成的開始即G1-S限制點(diǎn)，另一個(gè)在有絲分裂開始，即G2-M限制點(diǎn)，其中G1-S限制點(diǎn)更為重要，是生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外刺激作用的位點(diǎn)。G1-S限制點(diǎn)主要被一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK）調(diào)控，其中主要為Cyclin D/CDK4、CDK6 和 Cyclin E/CDK2 等[11-12]， 它 們 在VSMC由非增殖狀態(tài)向增殖狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中起決定性作用。cyclin D包括D1、D2、D3，作用類似于生長(zhǎng)因子傳感器，將細(xì)胞外的信號(hào)與細(xì)胞周期的進(jìn)行連接在一起，是CDK的活性輔助因子，cyclinD/CDK4(或 CDK6)對(duì) G1/S轉(zhuǎn)換是必需的[13]。P21和P27蛋白屬細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（CKI）家族，主要抑制G1-S限制點(diǎn)中的各種周期蛋白及CDK，使細(xì)胞停滯于G0-G1期。研究表明，P21、P27蛋白與VSMC增殖呈負(fù)相關(guān)[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDGF剌激后，培養(yǎng)VSMC cyclin D1和CDK4蛋白表達(dá)增強(qiáng)，P21蛋白表達(dá)下調(diào)，提示促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)因子活性增強(qiáng)，抑制因子活性降低，從而促進(jìn)了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化?？瞻籽獫{也可使cyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)輕度下調(diào)，P21蛋白表達(dá)輕度上調(diào)，可能與血漿中的抗凝劑EDTANa2的影響有關(guān)。阿托伐他汀含藥血漿和TPNS含藥血漿均可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC cyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)增強(qiáng)及P21蛋白表達(dá)下調(diào)，表明二者對(duì)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化的抑制作用與下調(diào)cyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)及上調(diào)P21蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（本文編輯 彭芝配）

Effects of total Panax notoginseng saponins on the expression of cell cycle-related proteins of rat vascular smooth muscle cells proliferation model

HUANG Xiao-ping， CHEN gang， DENG Chang-qing
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410208， China)

Objective To discuss the impacts of total Panax notoginseng saponin(TPNS)on the cell cycle-related protein in the proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)proliferating model induced by platelet-derived growth factor(PDGF).Methods A VSMC proliferating model was established induced by PDGF-BB and the effects of rat plasma containing drugs on the VSMC proliferation were observed. The expressions of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and cell cycle-related proteins were determined with flow cytometry.Results After being stimulated by PDGF,up-regulation of PCNA,cyclinD1,cyclin-dependent kinase-4(CDK4)and down-regulation of p21 protein in VSMCs were observed.These changes were inhibited by atorvastatin and TPNS drug-containing plasma，and these effects in both groups were not significant（P>0.05）.Conclusion PDGF can promote cell cycle conversion and quicken proliferation of VSMCs.Atorvastatin and TPNS maybe inhibit effectively the VSMC proliferation induced by PDGF with suppressing the expression of cell cycle-related proteins.

Total Panax notoginseng saponin；vascular smooth muscle cell；rat；proliferating cell nuclear antigen；cyclin D1；cyclin-dependent kinase 4

*鄧常清，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:dchangq@yahoo.cn。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.004.021.04

2012－02－19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30572301）。

黃小平（1974-），女，湖南常德人，醫(yī)學(xué)碩士，講師，主要從事心腦血管疾病的研究。