病毒性神經(jīng)壞死病病毒核酸檢測用標準物質(zhì)的制備

段燕喻，陳 茹，吳曉薇，朱道中，林志雄，田純見，劉志玲

（廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東省動植物與食品進出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東廣州 510623）

病毒性神經(jīng)壞死?。╒iral nervous necrosis，VNN）又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜病（Viral encephalopathy and retinopathy，VER）[1]。 其 病原為神經(jīng)壞死病病毒（Nervous necrosis virus，NNV），可感染多種石斑魚（Epinephelus akaara、Epinephelus septemfasciatus、Epinephelus fuscogutatus）[2-4]、尖 吻 鱸魚（Latescalcarife）[5]、大菱鲆[6]等40多種海水魚類。該病在世界范圍內(nèi)廣泛暴發(fā)，對仔魚和幼魚危害很大，感染后死亡率極高，嚴重的1周內(nèi)死亡率可達100%[7-8]。病魚主要表現(xiàn)為不同程度的神經(jīng)異常和厭食，浮于水面旋轉(zhuǎn)游動。組織學觀察可見視網(wǎng)膜、腦中樞神經(jīng)組織出現(xiàn)空泡。已有研究表明[3，9]，該病已從海水魚傳播到淡水魚，從幼魚傳播到成魚，給各國海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。VNN被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）、亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心協(xié)作網(wǎng)（NACA）列入水生動物病害名錄，被我國列為二類動物疫病。各國在進出境水生動物檢疫中，將其作為重要的檢疫項目。

目前國內(nèi)外已報道的VNN檢測方法大致可分為免疫學方法、分子生物學方法和細胞培養(yǎng)法3大類。其中：免疫學方法包括ELISA[10]、免疫熒光技術(shù)[11]、免疫組織化學方法等；分子生物學方法主要包括RT-PCR[12]、巢式RT-PCR[13]、實時熒光定量PCR[14]等。但由于細胞培養(yǎng)法耗時長，免疫學方法制備單克隆抗體難，因此這些方法在VNN臨床檢測中推廣難度較大。分子生物學檢測方法以檢測快速、特異好和敏感性高等優(yōu)點，在VNN檢測中得到廣泛應(yīng)用。

國內(nèi)外學者對VNN的RT-PCR檢測，較多選取RNA2基因設(shè)計引物及探針[15-17]。OIE《水生動物疾病診斷手冊》中推薦的VNN分子生物學方法也將RNA2基因作為目標基因。但由于缺少檢驗用的質(zhì)控標準物質(zhì)，影響了實驗室間檢測結(jié)果的比對和互認，且活病毒的流通存在生物安全風險，不利于質(zhì)控樣品的傳遞，因此開展VNN標準物質(zhì)研究，對確保核酸檢測陽性質(zhì)控均一、安全有效具有重要意義。

本研究根據(jù)OIE《水生動物疾病診斷手冊》推薦的VNN熒光RT-PCR檢測方法，設(shè)計特異性引物，擴增NNV的RNA2基因片段，經(jīng)克隆轉(zhuǎn)錄獲取大量的cRNA，將其作為NNV陽性核酸物質(zhì)，并從均一性、穩(wěn)定性、定值和不確定度等幾個方面進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌毒株及載體

NNV毒 株（Red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）為深圳出入境檢驗檢疫局動植食檢測中心水生實驗室贈送；pGEM-T Easy Vertor System II 載體為Promega公司產(chǎn)品；JM109大腸桿菌化學感受態(tài)細胞為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與試劑

7500FAST熒光PCR儀：ABI公司產(chǎn)品；NanoDrop1000紫外分光儀：ThermoFisher公司產(chǎn)品；冷凍干燥儀器：Christ公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒：Promega公司產(chǎn)品；一步法RTPCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶Nde I：TAKARA公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒：Axygen 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、RNA純化試劑盒：北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 標準物質(zhì)制備用毒株鑒定

RGNNV滅活病毒懸液由深圳出入境檢驗檢疫局國家水生動物疫病檢測重點實驗室贈送。采用OIE《水生動物疫病診斷手冊》（第2.3.11章）推薦的常規(guī)RT-PCR方法鑒定，將擴增產(chǎn)物進行序列測定后，與GenBank登錄的NNV序列進行同源性比對，確認該毒株為NNV，可將其用于NNV核酸檢測標準物質(zhì)的研制。

1.4 標準物質(zhì)制備

1.4.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)GenBank登錄的NNV毒株序列，以及OIE《水生動物疫病診斷手冊》中NNV檢測方法推薦的引物，選擇RNA2基因中相對保守區(qū)域，設(shè)計用于克隆NNV RNA2基因的特異性擴增引物（表1），并由Thermo Fisher公司合成。以病毒核酸為模板進行RT-PCR擴增后，對擴增產(chǎn)物進行序列測定。將序列正確的特異性基因片段連接于pGEM-Teasy載體，轉(zhuǎn)化至JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞；挑取白色菌落，經(jīng)RT-PCR鑒定及序列測定鑒定為陽性后，用天根公司的高濃度質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提??；將該重組質(zhì)粒命名為pGEM-RNA2。

表1 NNV RNA2基因的擴增引物

1.4.2 NNV RNA2基因體外轉(zhuǎn)錄 選擇重組質(zhì)粒中位于NNV RNA2基因下游的Nde I限制性內(nèi)切酶位點，對pGEM-RNA2進行單酶切，使其線性化后采用DNA 膠回收試劑盒純化，用T7 RiboMAXTMLarge scale RNA production system進行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄序列從pGEM-RNA2載體的啟動子開始至Nde I酶切位點止。轉(zhuǎn)錄體系總體積為100 μL，包含以下組分：T7 Transcription 5×Buffer 20 μL、dNTPs（25 mmol/L）30 μL、線性化質(zhì)粒5～10 μg、Enzyme Mix（T7）10 μL、ddH2O 40 μL。混勻后置37 ℃反應(yīng)5 h，接著向體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入10 μL DNA酶，37 ℃反應(yīng)15 min以去除DNA模板，最后用天根RNA純化試劑盒提取純化，去除體系中的雜質(zhì)。將RNA沉淀溶于RNase-Free H2O中，即得到純的RNA2-cRNA片段。

1.4.3 RNA2-cRNA純度及初步定量 取制備的RNA2-cRNA做100倍稀釋；用Nano Drop 1000紫外分光儀測定其在260 nm與280 nm處的OD值；根據(jù)OD260/OD280值分析溶液中的RNA純度。OD260/OD280在1.8～2.0，說明 RNA的純度較高；比值低于1.8，說明RNA樣品有殘余蛋白質(zhì)存在；比值高于2.0，則表明RNA可能降解。同時根據(jù)單鏈RNA的相對分子質(zhì)量（MW），按下式計算出RNA2-cRNA的拷貝數(shù)濃度?？截悢?shù)（copies/μL）=（6.02×1023拷貝數(shù) /mol）× 濃度（g/μL）/分子量（g/mol）。

1.4.4 RNA2-cRNA稀釋與分裝保存 將制備的RNA2-cRNA，用RNase-Free H2O系列稀釋成108～104copies/μL；采用熒光 RT-PCR 方法測定各濃度Ct值，從而獲得標準曲線，建立回歸方程。將108copies/μL的樣品混勻后分裝入凍存管，每管1.0 mL，分裝300管，分別保存于室溫（20～25 ℃）、冷藏（2～8 ℃）和冷凍（-20 ℃）。每個溫度下保存20支，剩余的保存于-80 ℃。

1.5 標準樣品檢測分析

1.5.1 均勻性檢驗 從-80 ℃保存的標準物質(zhì)樣品中，隨機抽取10支，編號后用OIE《水生動物疫病診斷手冊》第2.3.11章中的病毒性神經(jīng)壞死病熒光RT-PCR方法檢測Ct值，以此檢驗批間均勻性。從每管樣品分別抽取10 μL混合，用熒光RT-PCR方法測定10次，用于檢驗批內(nèi)均勻性。

1.5.2 穩(wěn)定性檢驗 不同溫度條件保存樣品時間如下：室溫（20～25 ℃）7 d；冷藏（2～8 ℃）1個月；冷凍（-20 ℃）6個月；冷凍（-80 ℃）長期保存。依次作為不同條件下的穩(wěn)定性對照組。各溫度條件保存期結(jié)束后，分別隨機抽取4支，應(yīng)用OIE推薦的熒光RT-PCR方法檢測Ct值；采用雙樣本等方差假設(shè)的t檢驗，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，評價標準物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.5.3 定值檢測與協(xié)作標定 本次定值采用測定標準物質(zhì)濃度，根據(jù)片段長度換算拷貝數(shù)和協(xié)作標定的方式，聯(lián)合7家權(quán)威實驗室，對制備好的標準物質(zhì)進行定值。

1.5.4 不確定度分析 本研究定值結(jié)果的不確定度主要包括設(shè)備、試劑和人員操作誤差。應(yīng)用A類評定方法進行不確定度評定。

2 結(jié)果

2.1 標準物質(zhì)制備用毒株鑒定和篩選

備用毒株經(jīng)OIE推薦的常規(guī)RT-PCR檢測方法鑒定為陽性；測序所得序列經(jīng)NCBI BLAST與GenBank登錄的其他NNV毒株序列比，發(fā)現(xiàn)同源性達95%以上。結(jié)果表明，所選取的RNA2基因可以有效代表NNV的核苷酸序列，可用于核酸檢測標準物質(zhì)的研制。

2.2 RNA2基因片段擴增

提取NNV病毒RNA，采用表1中的引物，成功擴增RNA2基因序列；擴增產(chǎn)物長度為677 bp，片段大小符合預(yù)期（圖1）。

圖1 NNV RNA2基因的RT-PCR擴增結(jié)果

2.3 RNA2-cRNA純度及含量

測定RNA2-cRNA 260 nm與280 nm的吸光度值（OD）。OD260/OD280=1.92，表明所獲得的cRNA純度較高。pGEM-RNA2的摩爾質(zhì)量為2.64×105g/mol；根據(jù)公式計算樣品的拷貝濃度為8.41×1012copies/μL（表 2）。

表2 RNA2-cRNA純度及含量

2.4 標準曲線

取稀釋成8.41×108～8.41×104copies/μL各濃度梯度的標準物質(zhì)，每個濃度設(shè)2個重復(fù)，進行實時熒光定量RT-PCR，測定Ct值。以標準物質(zhì)拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。由儀器自帶軟件得出標準曲線的回歸方程為Y= -4.327X+52.125，R2=0.958（圖2、圖3）。

圖2 不同稀釋度標準物質(zhì)的擴增曲線

2.5 均勻性檢驗

采用熒光定量RT-PCR方法，對隨機抽取的10支標準樣品與混合后的標準樣品測定Ct值（圖4），并將檢測結(jié)果進行方差分析（F檢驗法），計算管間變異系數(shù)和批內(nèi)均勻性。根據(jù)給定的顯著性水平a與自由度，查表得臨界的Fa值，再與兩組數(shù)據(jù)計算所得的F值進行比較。結(jié)果顯示F＜Fa，表明分裝的標準物質(zhì)在組內(nèi)與組間無明顯結(jié)果差異，均勻性良好（表3）。

圖3 不同稀釋度標準物質(zhì)的標準曲線

圖4 RNA2-cRNA標準物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果

2.6 標準物質(zhì)穩(wěn)定性試驗

將-80 ℃儲存的標準物質(zhì)作為對照組，其他溫度下保存的標準物質(zhì)作為檢測組，在不同溫度保存期結(jié)束后，隨機抽取4支進行熒光RT-PCR試驗測定Ct值。將每組數(shù)據(jù)分別與對照組作“雙樣本等方差假設(shè)”的t檢驗。因各組P值均＞0.05，故其結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義（表4），表明各檢測組在穩(wěn)定性監(jiān)測期內(nèi)是穩(wěn)定的。

表3 RNA2-cRNA標準物質(zhì)均勻性檢驗方差分析結(jié)果

表4 RNA2-cRNA標準物質(zhì)穩(wěn)定性t檢驗統(tǒng)計結(jié)果

2.7 標準物質(zhì)定值檢測與協(xié)作標定

本次定值采用測定標準物質(zhì)濃度，根據(jù)片段長度換算拷貝數(shù)和協(xié)作標定的方式，計算標準物質(zhì)含量（copies/μL）。本研究中共有8家單位參加協(xié)作標定。參加單位采用統(tǒng)一的試驗設(shè)計方案、實施方案和結(jié)果分析程序，分別取得3次獨立的有效結(jié)果。最終取8家單位平均值作為定值結(jié)果（表5）。

2.8 標準物質(zhì)不確定度

通過對實際檢測過程進行分析，確定標準品的總不確定度，包括分析測定誤差、RNA提取中的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。應(yīng)用A類評定方法進行不確定度分析，經(jīng)SPSS軟件計算的RNA2-cRNA標準物質(zhì)不確定度為0.068×108copies/μL，定值為（8.452±0.068）×108copies/μL（表5）。

表5 RNA2-cRNA標準物質(zhì)定值結(jié)果

3 討論

核酸標準物質(zhì)屬于生物分子水平標準物質(zhì)的一種，是指用于核酸擴增技術(shù)的標準物質(zhì)。世界衛(wèi)生組織（WHO）1997年首次發(fā)布了用于核酸擴增技術(shù)的核酸標準物質(zhì)——丙型肝炎核酸（HCV）、乙型肝炎核酸（HBV）國際標準物質(zhì)。核酸標準物質(zhì)在醫(yī)學領(lǐng)域的某些疾病中應(yīng)用較成熟。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，核酸標準物質(zhì)應(yīng)用于動物檢疫的報道也越來越多。張桂山等[18]制備了小尾寒羊瘦素長型受體基因?qū)崟r熒光定量PCR標準品質(zhì)粒；谷強等[19]對新城疫病毒病毒核酸檢測標準物質(zhì)進行了研究；吳亞瓊等[20]和孫濤等[21]分別對亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒核酸標準物質(zhì)進行了制備和研究。核酸標準物質(zhì)在促進病原核酸擴增檢測方法標準化及提高檢測一致性和準確性方面發(fā)揮了重要作用。

準確性、均勻性與穩(wěn)定性是標準物質(zhì)最重要的屬性。本研究建立的RNA-cRNA標準物質(zhì)可作為VNN準確診斷的陽性質(zhì)控。均勻性檢驗表明其樣品間與樣品內(nèi)無顯著差異；穩(wěn)定性檢驗表明該標準物質(zhì)在監(jiān)測內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合標準物質(zhì)要求。

普通RT-PCR和熒光定量RT-PCR是OIE《水生動物疫病診斷手冊》中推薦的VNN快速診斷方法。本研究采用體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建基于NNV RNA2基因的RNA標準物質(zhì)，為VNN的特異性診斷設(shè)立了對照。在實際檢測中，該標準物質(zhì)可在擴增檢測的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增2個方面進行質(zhì)量控制，符合RNA病毒檢測標準物質(zhì)的要求[22]。轉(zhuǎn)錄的RNA-cRNA片段無生物安全隱患，同時不易出現(xiàn)對實驗環(huán)境和儀器造成交叉污染而導致的假陽性結(jié)果，具有良好的適用性。

4 小結(jié)

該定值RNA標準物質(zhì)為我國VNN檢測提供了技術(shù)支撐。同時，該標準物質(zhì)使得VNN診斷中不同方法、設(shè)備、試劑、人員間具有了可比性與可溯源性。該標準物質(zhì)可在我國各檢驗檢疫實驗室及各地方水產(chǎn)技術(shù)推廣站推廣應(yīng)用，可推進我國VNN檢測的標準化進程。

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