安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚對(duì)P-糖蛋白功能的影響

楊 洋， 王世祥， 房敏峰， 楊凌鑒， 孟 雪，2， 鄭曉暉，2*

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069;2.深圳清華大學(xué)研究院，廣東深圳518057)

芳香開(kāi)竅藥物蘇合香、安息香、石菖蒲性味辛，入心經(jīng)，辛香走竄、芳香開(kāi)竅，提高血腦屏障通透性。蘇合香、安息香對(duì)D-氨基半乳糖敏化小鼠內(nèi)毒素致死性攻擊具有保護(hù)作用［1］，明顯延長(zhǎng)急性缺氧損傷小鼠的存活時(shí)間［2］。石菖蒲具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和益智健腦作用［3］，能促進(jìn)羥基紅花黃色素A、葛根素、川芎嗪進(jìn)入腦組織內(nèi)［4］。蘇合香、安息香、石菖蒲均可明顯升高正常小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含有量［4-5］。但芳香開(kāi)竅藥物開(kāi)放血腦屏障是否與P-gp外排功能有關(guān)，報(bào)道較少［5-6］。本研究采用P-gp高表達(dá)Caco-2細(xì)胞，對(duì)蘇合香、安息香和石菖蒲有效成分安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚與P-gp外排功能關(guān)系進(jìn)行研究，為揭示蘇合香、安息香和石菖蒲開(kāi)竅醒腦作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑 安息香醛、香草醛、β-細(xì)辛醚、羅丹明-123(Rho-123)、四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、維拉帕米 (Ver)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.1%胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(美國(guó)GIBCO公司);T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (美國(guó)Corning公司);色譜純乙腈 (美國(guó)Fisher公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水 (自制);其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 CB150型CO2培養(yǎng)箱 (德國(guó) Binder公司);TE2000—U倒置相差顯微鏡 (日本 Nikon公司);TDL—40B型低溫高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);高效液相系統(tǒng)為Agilent 1100系列高效液相色譜儀，包括脫氣機(jī)，二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，熒光檢測(cè)器 (美國(guó)Agilent公司);BP221S電子天平 (德國(guó)Sartorius公司)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密稱取Rho-123適量，置于5.0 mL的棕色量瓶中，加10%DMSO至刻度，制得質(zhì)量濃度為3.8 mg/mL的溶液。同法制備質(zhì)量濃度均為10.0 mg/mL的β-細(xì)辛醚、香草醛和安息香醛10%DMSO溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備 取細(xì)胞培養(yǎng)液1.0 mL，置于5.0 mL琥珀色Eppendorf管中，加入20.0 μL 20%三氯乙酸水溶液沉淀蛋白，渦旋2.0 min，12 000 r/min離心10 min，取出上清液，過(guò)0.45 μm水系微孔濾膜，備用。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2細(xì)胞接種于T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%L-谷氨酰胺。置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%時(shí)用EDTA、胰酶消化并傳代，用30～38代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 MTT試驗(yàn) 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度為1×105個(gè)/mL，每孔終體積為200 μL。上述條件下培養(yǎng)24 h，吸盡每孔培養(yǎng)液，分別加入含有不同質(zhì)量濃度的安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚培養(yǎng)液，并設(shè)調(diào)零孔。37℃培養(yǎng)5 h，每孔加MTT(5 mg/mL)液20.0 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4.0 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，將結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔的吸光度 (A)，細(xì)胞存活率 (%)=實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組平均A值×100%，選取細(xì)胞存活率90%的藥物濃度作為非細(xì)胞毒性濃度。

2.5 藥物對(duì)P-gp外排功能的影響 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞 (1×105個(gè)/mL)接種于24孔培養(yǎng)板，每孔終體積為1.5 mL。培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液更換成分別含有1.0 μg/mL安息香醛、香草醛、β-細(xì)辛醚和5.0 μg/mL維拉帕米的培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h后加入0.38 mg/mL Rho-123 10.0 μL，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h或1.0 h，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液。

2.6 Rho-123測(cè)定

2.6.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水 (1%三乙胺)(35∶65，pH=3.0);體積流量0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):Ex=485 nm，Em=546 nm;進(jìn)樣量 20.0 μL。

2.6.2 線性關(guān)系及檢測(cè)限 取細(xì)胞培養(yǎng)液1.0 mL，加入Rho-123標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備質(zhì)量濃度為 0.003、0.015、0.03、0.15、0.3、1.5、3.0 μg/mL的空白細(xì)胞培養(yǎng)液加標(biāo)溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在擬定色譜條件下進(jìn)樣分析。

2.6.3 回收率和精密度 取細(xì)胞培養(yǎng)液1.0 mL，加入Rho-123標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制0.003、0.03、0.3 μg/mL低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的空白細(xì)胞培養(yǎng)液加標(biāo)溶液各3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在擬定色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次;將上述樣品溶液在5 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次。

2.6.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的空白細(xì)胞培養(yǎng)液加標(biāo)溶液，室溫下避光放置4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在擬定色譜條件下進(jìn)樣。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果表明，β-細(xì)辛醚和香草醛質(zhì)量濃度為0.01～10.0 μg/mL、安息香醛質(zhì)量濃度為0.01～50.0 μg/mL、Rho-123質(zhì)量濃度為 0.38～19.0 μg/mL和維拉帕米質(zhì)量濃度為1.25～5.0 μg/mL時(shí)，對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)毒性作用，Caco-2存活率均大于90%(見(jiàn)表1、表2)。

表1 安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響(n=6)

表2 Rho-123和維拉帕米對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響(n=6)

3.2 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中Rho-123質(zhì)量濃度的影響

3.2.1 方法學(xué)研究 在擬定色譜條件下進(jìn)樣分析。圖1為細(xì)胞培養(yǎng)液的HPLC色譜圖。Rho-123不受其他物質(zhì)的干擾，專屬性較好。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 709.6X+7.84及相關(guān)系數(shù) r=0.999 8。由此看出，在0.003～3.0 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，回歸方程線性良好，檢出限為0.000 3 μg/mL。0.003、0.03、0.3 μg/mL 低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的回收率分別為69.37% ±3.82%、72.33% ±6.75%和70.73%±5.94%，日內(nèi)精密度RSD分別為3.07%、1.98%和3.18%，日間精密度 RSD分別為6.78%、3.75%和4.31%，穩(wěn)定性試驗(yàn) RSD值分別為4.02%、3.57%和6.45%。

圖1 樣品的HPLC圖譜

3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中Rho-123質(zhì)量濃度的測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)果表明，加入Rho-123 0.5 h和1.0 h后，安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚孔細(xì)胞培養(yǎng)液中Rho-123的質(zhì)量濃度與對(duì)照孔比較明顯降低 (見(jiàn)表3)。提示安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚可明顯促進(jìn)Caco-2細(xì)胞對(duì)Rho-123的攝取。

表3 β-細(xì)辛醚、香草醛、安息香醛對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中Rho-123質(zhì)量濃度的影響 (n=10)

4 討論

P-gp 是ATP-結(jié)合盒藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中最重要的成員之一，可利用ATP水解的能量將生物毒性物質(zhì)包括多種藥物泵出細(xì)胞而達(dá)到保護(hù)的機(jī)體作用。在胃腸道上P-gp的表達(dá)從胃、十二指腸到結(jié)腸逐漸增加［8］，P-gp在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈高度表達(dá)［9］，在腔面膜的表達(dá)為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的17倍、為整個(gè)腦組織的400～500倍，而且主要在大腦微血管上皮細(xì)胞的腔膜和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞尖端膜有大量的表達(dá)［10-11］。在心臟、膽管側(cè)膜與腎近曲小管等部位P-gp亦有表達(dá)，成為影響藥物的吸收、分布和代謝的重要因素［12］。

蘇合香、安息香、石菖蒲“芳香走竄，引經(jīng)上行”。蘇合香、安息香對(duì)小鼠生理狀態(tài)下的血腦屏障具有一定的開(kāi)放效應(yīng)，明顯升高正常小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含有量［5］。石菖蒲可使大鼠血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接松弛，增加小鼠大腦內(nèi)5-羥色胺的含有量，石菖蒲具有抑制Hela細(xì)胞膜上P-糖蛋白的藥物外排作用，提高血腦屏障通透性可能與揮發(fā)油有關(guān)，但成分不明［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，蘇合香、安息香和石菖蒲有效成分安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚可明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)液中P-gp底物Rho-123的質(zhì)量濃度，促進(jìn)Caco-2細(xì)胞對(duì)Rho-123的攝取，對(duì)P-gp外排功能具有明顯的抑制作用。提示抑制P-gp功能為蘇合香、安息香、石菖蒲辛香走竄、芳香開(kāi)竅、提高血腦屏障通透性的作用機(jī)制之一。

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