鴉膽子油HPLC-ELSD指紋圖譜研究

郭 輝， 胡 晨， 錢俊青， 李 宏， 岳昌林

(1.浙江九旭藥業(yè)有限公司，浙江金華321016;2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014)

鴉膽子又名老鴉膽 Brucea javanica(L．)Merr．，苦參子。性寒，味苦，有小毒，歸大腸和肝經(jīng)。中醫(yī)以其清熱解毒、截瘧、止痢，腐蝕贅疣等功效，一般用于熱性赤痢、便血、瘧疾、雞眼及疣等治療，為《中華人民共和國藥典》收載品種［1-3］。鴉膽子中含有20%左右的脂肪油類成分，即鴉膽子油。七十年代以來許多研究表明鴉膽子油是一種療效確切的新型廣譜抗腫瘤藥，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，用于消化道腫瘤、肺癌及宮頸癌等的治療［4-6］。鴉膽子油的主要成分是甘油三酸酯，相關(guān)文獻(xiàn)采用GC分析鴉膽子油中甘油三酯的脂肪酸成分，表明鴉膽子中的脂肪酸主要是油酸、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸和硬脂酸［7］，活性成分主要是油酸和亞油酸。目前，在鴉膽子油的質(zhì)量控制中一般采用GC方法分析控制脂肪酸成分［8-9］，這套分析評價方法中，對鴉膽子油中原有甘油三酸酯類成分先進(jìn)行水解，然后再進(jìn)一步甲酯化確定成分，過程檢測的是鴉膽子油水解產(chǎn)物脂肪酸，同時由于氣相操作溫度過高，原有一些不飽和脂肪酸類成分容易氧化。另一方面由于甘油三酯在紫外區(qū)基本無吸收，當(dāng)前采用HPLC方法分析鴉膽子油一般是采用柱前衍生化的方法，將其水解成脂肪酸再對其進(jìn)行酯化使其產(chǎn)生紫外吸收進(jìn)行分析［10-11］，該衍生化過程操作繁瑣。而蒸發(fā)光散射檢測器對無紫外吸收的成分能夠提供較好的檢測結(jié)果，國內(nèi)外一些相關(guān)的研究表明蒸發(fā)光檢測器對于油脂類成分分析檢測有較好的響應(yīng)結(jié)果［12-13］。本實驗建立 HPLCELSD特征指紋圖譜方法，為有效控制和科學(xué)評價鴉膽子油的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配chemstation色譜工作站，包括四元高壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱);Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器;Agilent 6210 LC/TOF液質(zhì)聯(lián)用儀;Sartorius電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);HWS24型電熱恒溫水浴鍋 (上海一恒科技有限公司);R—201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海申生科技有限公司);正己烷、異丙醇 (色譜級，天津博迪化工有限公司);乙腈、甲醇 (色譜級，默克公司)。

1.2 試藥 鴉膽子 (浙江九旭藥業(yè)有限公司提供)批號及來源見表1;三油酸甘油酯對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號111692-200501)。

表1 鴉膽子油批號及來源Tab.1 Batches and sources of Brucea javanica oil

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱;流動相為66%乙腈，20%異丙醇，14%正己烷;體積流量1.0 mL/min;蒸發(fā)光檢測器，檢測溫度70℃;載氣流量1.5 mL/min;進(jìn)樣量 2 μL。

2.2 對照溶液的制備 取三油酸甘油酯對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為3.019 mg/mL的對照品溶液，冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備 取鴉膽子粗粉約3 g，精密稱定，加入石油醚 (60～90℃)30 mL，超聲處理 (功率280 W，頻率42 Hz)30 min，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用石油醚 (60～90℃)30 mL，分次洗滌濾器和濾渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去溶劑，獲得鴉膽子油。取0.1 g鴉膽子油溶于異丙醇中，并定容至10 mL。0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取20100101批次藥材，制備成供試品溶液，按2.1項下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測得其各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取20100101批次藥材，制備成供試品溶液6份，按2.3項下操作制備供試品溶液，按2.1項下方法分別進(jìn)樣，測得其各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取20100101批次藥材，制備成供試品溶液，按2.1項下方法分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，其各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 樣品測定 取10批鴉膽子樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下依次進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，共獲得9個共有峰。典型鴉膽子油色譜圖見圖1。

圖1 鴉膽子油色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Brucea javanica oil

2.6 特征指紋圖譜的建立

2.6.1 參比峰的選擇 在各批次樣品圖譜中三油酸甘油酯的色譜峰 (6號峰)峰位居中，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定三油酸甘油酯為參照峰。以其保留時間和峰面積為1.0，計算各批指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.6.2 特征指紋圖譜的建立及相似度評價 將所得的10批鴉膽子油HPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價》軟件 (2004年A版)，以S1批藥材譜圖作為參照譜進(jìn)行指紋匹配，建立了共有模式見圖2。相似度分析見表2。

圖2 10批鴉膽子油HPLC特征指紋圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of 10 batches of Brucea javanica oil

表2 鴉膽子油指紋圖譜相似性分析Tab.2 Results of 10 batches of Brucea javanica oil sample similarity

2.7 HPLC-MS分析 采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對鴉膽子的化學(xué)成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測。結(jié)構(gòu)鑒定依據(jù)是:APCI質(zhì)譜中甘油三酸酯裂解成甘油二酸酯，裂解出來的甘油二酸酯相對豐度會存在一定差異，一般在APCI質(zhì)譜中存在分子離子峰以及一些裂解單脂肪酸的甘油二酸酯峰，而這些甘油二酸酯［M+H·RiCOOH］+的相對豐度可以說明脂肪酸是否處于sn-2位置，甘油三酸酯在sn-2位置裂解出脂肪的離子碎片 ［M+H·R2COOH］+，需要更大能量，可能性較?。?4-16］。由此結(jié)合分子量和相對豐度，指認(rèn)出油酸亞麻酸亞油酸甘油酯 (1號峰)、1，2-二亞油酸-3-油酸甘油酯 (2號峰)、1，2-二亞油酸-3-軟脂酸甘油酯 (3號峰)、1，3-二油酸-2-亞油酸甘油酯 (4號峰)、油酸亞油酸軟脂酸甘油酯 (5號峰)、三油酸甘油酯 (6號峰)、軟脂酸亞油酸硬脂酸甘油酯 (8號峰)和1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯 (9號峰)。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 根據(jù)制備工藝及樣品的理化性質(zhì)，選用石油醚 (60～90℃)為提取溶劑，采用索氏提取、回流提取、超聲提取等提取方式分別提取樣品進(jìn)行考察，結(jié)果幾種方法提取所得樣品各成分基本無差別，為簡便及降低成本和節(jié)約時間，采用超聲法進(jìn)行提取。

表3 HPLC-MS分析結(jié)果Tab.3 Result of HPLC-MS analysis

3.2 流動相的選擇 本實驗分別考察了三氯甲烷-乙腈、三氯甲烷-正己烷-乙腈、異丙醇-甲醇-乙腈、異丙醇-三氯甲烷-乙腈、正己烷-異丙醇-乙腈5個流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用正己烷-異丙醇-乙腈流動相系統(tǒng)，各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析，因此最終采用正己烷-異丙醇-乙腈系統(tǒng)作為流動相系統(tǒng)。

3.3 色譜柱的選擇 考察了相同色譜條件下采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-Phenyl(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)等色譜柱對鴉膽子油分離結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，使用 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，鴉膽子油中各成分分離度高，色譜峰尖銳，峰形較好，分離時間較短。

3.4 蒸發(fā)光檢測器檢測溫度的選擇 考察了相同色譜條件下蒸發(fā)光檢測器檢測溫度為50℃、60℃、70℃時對鴉膽子油分離結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，50、60℃條件下基線噪音比較大，70℃效果較好。

3.5 指紋圖譜評價 對采自海南、廣州、佛山、深圳、廈門的10批鴉膽子油進(jìn)行了指紋圖譜分析，不同產(chǎn)地、批次鴉膽子油中主要成分的量略有差異，但指紋圖譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，經(jīng)相似度計算，10批樣品指紋圖譜相似度均在0.996以上，不同產(chǎn)地、批次的鴉膽子油指紋圖譜無顯著性差異。

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