酶解超聲輔助卵磷脂的提取工藝

趙彥巧，李建穎，吳子健，王文忠

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

蛋黃卵磷脂在我國的市場占有量還非常少。隨著人民生活水平的提高，大力開發(fā)卵黃卵磷脂提取技術(shù)，提高雞蛋的加工水平和商品價值，改善蛋黃卵磷脂工藝，使其產(chǎn)率提高，降低成本成為迫在眉睫的任務(wù)。目前制備蛋黃卵磷脂一般采用有機溶劑萃取法、柱層析法、乙?；╗1-2]，超聲輔助和酶解法可以使產(chǎn)率大大提高[3-4]。

本實驗中將采用酶解超聲輔助法提取蛋黃卵磷脂。以蛋黃粉為原材料，選擇胃蛋白酶最佳濃度后對超聲條件進行選擇，并通過正交實驗確定蛋黃卵磷脂的提取最佳工藝，提高卵磷脂的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蛋黃粉：購于北京金健力蛋粉廠；鉬酸銨、磷酸二氫鉀、1-氨酸-2-萘酚-4-磺酸、亞硫酸氫鈉、無水亞硫酸鈉、四硼酸鈉（pH 9.18）、混合磷酸鹽（pH 6.86）、乙醇95%、無水乙醇等試劑：購于天津市江天化工技術(shù)有限公司，皆為分析純；丙酮、硫酸：購于天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司，分析純；胃蛋白酶：購于中國上?；瘜W(xué)試劑有限公司，酶活力（U/g）≥1 200.0。

FA1004 型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BKH-C 玻璃儀器氣流烘干器：長城科工貿(mào)有限公司；DGG-H-3 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞英生化儀器廠；SK5210LHC 超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；XMTD-204 型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；PHS-3B 型精密pH 計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-7504 型紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；DL-6000 型低速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 提取實驗方法

取一定量蛋黃粉，加入去離子水并不停攪拌，使蛋黃粉充分?jǐn)噭颉Ｓ名}酸調(diào)pH 至2，加入胃蛋白酶充分?jǐn)嚢?，使其酶解。待酶解反?yīng)充分后，對酶解液進行破乳[4]，用氫氧化鈉調(diào)pH 至5，90 ℃水浴15 min。所得蛋黃液離心15 min（4 000 r/min），獲取第二層膠狀脂質(zhì)體。取一定量酶解離心后的膠狀脂質(zhì)體，加入溶劑進行超聲提取，超聲頻率35 kHz。提取液旋蒸后，得粗卵磷脂，粗卵磷脂乙醇溶液用丙酮洗滌多次，直至洗滌液無色，真空干燥即得精制卵磷脂。

1.3 卵磷脂的分析方法

由于卵磷脂是一種含磷的生理物質(zhì)，因此采用鉬藍(lán)比色法測定卵磷脂含量，即用鉬酸銨定磷法測定產(chǎn)品中有機磷的含量，間接反映卵磷脂的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋黃粉原料成分常規(guī)分析

蛋黃粉原料成分的常規(guī)分析結(jié)果見表1。

表1 蛋黃粉原料成分Table1 The content of egg yolk powder%

2.2 胃蛋白酶濃度對卵磷脂提取的影響

胃蛋白酶的添加量不同，蛋黃粉中蛋白質(zhì)的肽鍵水解程度不同，蛋白質(zhì)和脂類的分離受到影響，從而影響了脂類在乙醇的溶解，導(dǎo)致卵磷脂的提取率不同。胃蛋白酶濃度對蛋白質(zhì)水解程度的影響曲線見圖1。

隨著酶濃度的增加，磷脂的提取率不斷增加。這是由于隨著酶濃度的增加，胃蛋白酶和底物接觸的機會大大增加，在相同時間內(nèi)水解的分子數(shù)也隨之增加，可以使磷脂分離得更快、更徹底。當(dāng)胃蛋白酶濃度到6.25 mg/mL 時，磷脂的提取率最大。但是，當(dāng)酶的濃度超過6.25 mg/mL 后，酶濃度的增加對提取率的影響很小。此時酶的濃度超過與底物反應(yīng)所需酶量，一部分酶分子無底物與之結(jié)合，因此提取率隨酶濃度的增加變化不大[5]。為了節(jié)約成本和資源，確定胃蛋白酶最佳濃度為6.25 mg/mL。

2.3 溫度對卵磷脂提取率的影響

考察了溫度對卵磷脂產(chǎn)率影響，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對卵磷脂提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on lecithin extraction

可以看出，從25℃開始卵磷脂提取率隨溫度的提高而逐漸增加，達(dá)到45℃時提取率達(dá)到最大，超過45℃反而下降。卵磷脂的提取過程是固-液相之間的擴散過程。當(dāng)溫度較低時，適當(dāng)提高提取時的溫度可以增加分子的動能，使溶質(zhì)擴散的速度加快，從而使提取率增加[6]。但高于45℃后，提取率反而隨溫度升高而下降。提取率下降的原因可能是由于卵磷脂溶于乙醇是放熱反應(yīng)，卵磷脂的溶解度隨溫度的上升而減少，也可能是溫度升高加速卵磷脂氧化分解。因此在卵磷脂的提取過程中，應(yīng)該保持一定的溫度范圍，保證卵磷脂有較高的提取率。由圖中可以看出提取卵磷脂的最適溫度在45℃。

2.4 時間對卵磷脂提取率的影響

圖3 時間對卵磷脂產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of time on lecithin extraction

提取時間對卵磷脂提取的影響見圖3。隨著時間的增長，卵磷脂的提取率不斷提高。在30 min 時達(dá)到最大。超過30 min 后，卵磷脂提取率有小幅下降之后緩慢上升。這是由于需要提取一定時間后，原料才能全部溶開與乙醇充分結(jié)合，從而破壞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)間的共價鍵，卵磷脂的提取率有所提高。但超過40 min后提取率反而下降，可能是在提取過程中存在卵磷脂的氧化和乙醇揮發(fā)，從而影響了卵磷脂提取率。在實驗范圍內(nèi)卵磷脂最佳提取時間為30 min。

2.5 溶劑濃度對卵磷脂提取率的影響

提取卵磷脂常用溶劑為乙醇，但不同濃度的乙醇提取卵磷脂的效果不同。考察了濃度為60%、70%、90%、95%、100%的乙醇對卵磷脂提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對卵磷脂產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of concentration of ethanol on lecithin extraction

可以看出，乙醇濃度在60%到90%時，卵磷脂提取率隨乙醇的濃度升高而升高，在到達(dá)90%達(dá)到最高；當(dāng)乙醇濃度超過90%時，隨著乙醇濃度的升高卵磷脂的提取率反而降低。這是由于在乙醇濃度低的時候，溶劑的極性和卵磷脂的極性相差較大，隨著濃度的提高，兩者的性質(zhì)越來越相似，卵磷脂在乙醇中的溶解度也越來越大，從而卵磷脂的提取率也會隨之增加。但超過90%后時，兩者的性質(zhì)相差也越來越大，因此卵磷脂的提取率會逐漸下降。所以在保證卵磷脂產(chǎn)率的前提下，考慮原材料、經(jīng)濟成本綜合因素后選取90%乙醇作為提取蛋黃卵磷脂溶劑。

2.6 溶劑用量對卵磷脂提取率的影響

向一定量的原料液中（原始蛋黃粉5 g）分別加入20 mL、40 mL、80 mL、120 mL、160 mL 乙醇進行提取，溶劑用量對卵磷脂提取率的影響見圖5。

由圖5 可見，乙醇用量在20～80 mL 時卵磷脂的提取率隨乙醇用量增加大幅提高，當(dāng)達(dá)到80 mL，即料液比為1︰16 時卵磷脂提取率最高；但超過80 mL 后，卵磷脂提取率變化幅度不大。這是由于隨著乙醇用量的增加，可以使原料液中的卵磷脂與乙醇融合充分。但是從經(jīng)濟角度考慮，提取時溶劑用量過大，導(dǎo)致原材料浪費，成本提高，而產(chǎn)率變化不大。因此選用適量的提取劑可以獲得更大的效益?？梢钥闯鲆掖甲罴延昧繛?0 mL，即料液比為1︰16（g/mL），1 g 蛋黃粉所需要乙醇16 mL。

2.7 正交試驗優(yōu)選提取工藝

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，各因素分別選取3 個水平進行酶解超聲輔助提取卵磷脂的正交試驗，其結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗因素水平表及極差分析Table 2 Results of L9（34）orthogonal experiments

比較三個因素的極差R

C（乙醇濃度）B（時間）D（料液比）A（溫度）

由表2 可以看出，影響蛋黃卵磷脂提取率的4 個因素的顯著關(guān)系從主到次的順序為乙醇濃度、時間、料液比、溫度，酶解超聲輔助提取卵磷脂的最佳工藝為A1B1C1D1，即溫度為35 ℃，反應(yīng)時間30 min，乙醇濃度為90%，乙醇量為60 mL（料液比為1︰12（g/mL）），此時卵磷脂的提取率最高為80.64%。

3 結(jié)論

以蛋黃粉為原料，通過酶解超聲輔助法對蛋黃卵磷脂的提取進行研究。選取了胃蛋白酶的最適添加量，并對超聲溫度、時間、乙醇濃度、料液比進行研究，通過正交試驗對影響卵磷脂的四個因素進行考察，優(yōu)化卵磷脂提取工藝。酶解超聲輔助法的最佳工藝條件為：酶濃度6.25 mg/mL，超聲頻率35 kHz，溫度為35 ℃，時間30 min，乙醇濃度為90%，料液比為1︰12（g/mL）。此時卵磷脂的提取率為80.64%。

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