秦川牛血紅素提取工藝的研究

馬志科，昝林森，馬 麗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

秦川牛血紅素提取工藝的研究

馬志科，昝林森＊，馬 麗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

以秦川牛血為原料提取血紅素，選擇影響提取的主要因素——氯仿加入量、酸性丙酮加入量、p H分別作為單因素進(jìn)行梯度試驗(yàn)，確定其合適范圍，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)選取最佳提取條件。結(jié)果表明，提取血紅素的最佳工藝為氯仿加入量為血溶體積的5倍，酸性丙酮加入量為血球蛋白濾液的5倍，調(diào)節(jié)p H4～5。

秦川牛；血紅素；提取工藝

血紅素（heme）是血紅蛋白組成不可缺少的組分，它是由原卟啉IX與Fe2＋結(jié)合而成，與珠蛋白結(jié)合成血紅蛋白。它在體內(nèi)主要的生理功能是載氧，幫助呼出CO2，除在血紅蛋白、肌紅蛋白中擔(dān)負(fù)O2和CO2運(yùn)輸外，還是細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素C、過氧化物酶的輔基。臨床上它可作為有機(jī)鐵補(bǔ)血藥［1］、抗貧血藥［2］，臨床上均有顯著療效。它也是制備抗癌特效藥——血卟啉衍生物的原料［3］。在食品工業(yè)上可用于食品強(qiáng)化劑，食用色素等［4］。提取血紅素的方法較多，不同的方法各有其特點(diǎn)，影響的因素也較多。本文參考相關(guān)資料［5－9］，對(duì)秦川肉牛血紅素提取工藝進(jìn)行研究，旨在完善提取血紅素的方法，為綜合開發(fā)牛血資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

秦川肉牛血采自楊凌某屠宰場(chǎng)；血紅素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品；檸檬酸三鈉，氯仿，NaCl，HCl，NaOH，丙酮等均為分析純。酸度計(jì)（PHS－3C）為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電子分析天平（BS210S）為北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)（LD4－2）為北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品；真空干燥箱（DZF－3）為上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；紫外可見光度計(jì)（UV1100）為上海美譜達(dá)儀器公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 工藝流程 新鮮抗凝牛血→離心→紅細(xì)胞→洗滌→溶血→加氯仿→分離血紅蛋白→過濾去纖維→加酸性丙酮溶液攪拌→抽提得血紅素溶解液→氫氧化鈉沉淀→HCl調(diào)p H→沉淀→干燥得血紅素。其中，抗凝劑為檸檬酸三鈉，每升新鮮牛血加25 g。離心條件為3 000 r／min，15 min。洗滌用9 g／L的NaCl溶液。溶血用加等體積紅細(xì)胞的去離子水。

1．2．2 氯仿加入量對(duì)提取血紅素的影響 試驗(yàn)設(shè)置氯仿加入量分別為血溶體積的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍，分離血球蛋白濾液。以血紅素提取量（g／L）為指標(biāo)，選擇氯仿加入量的適宜范圍。

1．2．3 酸性丙酮加入量對(duì)提取血紅素的影響 酸性丙酮為含丙酮30 m L／L的鹽酸，試驗(yàn)設(shè)置酸性丙酮加入量分別為血球蛋白濾液的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍，抽提血紅素。以血紅素提取量（g／L）為指標(biāo)，選擇酸性丙酮加入量的適宜范圍。

1．2．4 p H對(duì)提取血紅素的影響 提取血紅素濾液用NaOH處理后，用1 mol／L HCl分別調(diào)p H為6．0、5．0、4．0和3．0。以血紅素提取量（g／L）為指標(biāo)，選擇適宜p H范圍。

1．2．5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇的適宜范圍，通過L9（33）正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。

1．2．6 血紅素含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［10］繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在OD385 nm下測(cè)定樣品含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 氯仿加入量對(duì)提取血紅素的影響

紅細(xì)胞溶血后，加入氯仿分離血球蛋白濾液，氯仿加入量對(duì)提取血紅素的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，氯仿加入量在2倍～5倍范圍內(nèi)，隨加入量增加時(shí)，血紅素含量快速增加。超過5倍繼續(xù)增加時(shí)，血紅素含量緩慢增加。

2．2 酸性丙酮加入量對(duì)提取血紅素的影響

血紅蛋白溶液用酸性丙酮溶液浸提，酸性丙酮加入量對(duì)提取血紅素的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，酸性丙酮加入量由2倍增至3倍，血紅素含量緩慢增加。加入量在3倍～5倍時(shí)，血紅素含量快速增加，超過5倍繼續(xù)增加時(shí)，血紅素含量緩慢增加。

圖1 氯仿加入量對(duì)提取血紅素的影響Fig．1 The effect of added chloroform volume on heme extraction

圖2 酸性丙酮加入量對(duì)提取血紅素的影響Fig．2 The effect of added acid acetone volume on heme extraction

2．3 p H對(duì)提取血紅素的影響

提取血紅素濾液用NaOH處理后，用1 mol／L HCl調(diào)節(jié)不同p H，p H對(duì)提取血紅素的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，p H從6～4，血紅素含量迅速增加，p H從4～3，血紅素含量迅速下降，說明p H對(duì)提取血紅素影響較大。

2．4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9（33）正交表，設(shè)置三水平，氯仿加入量為血溶體積的4倍、5倍、6倍；酸性丙酮加入量為血紅蛋白濾液體積的4倍、5倍、6倍；p H 選擇為4．0、5．0、6．0。進(jìn)行正交試驗(yàn)，以血紅素提取量（g／L）為指標(biāo)，優(yōu)化提取血紅素的工藝參數(shù)，結(jié)果見表1。

圖3 p H對(duì)提取血紅素的影響Fig．3 The effect of p H on heme extraction

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal trial results

從表1可以看出，三個(gè)因素對(duì)提取血紅素含量都有影響。極差R最大的因素是p H，其次是酸性丙酮加入量和氯仿加入量，即對(duì)提取血紅素含量影響程度大小順序?yàn)閜 H＞酸性丙酮加入量＞氯仿加入量。從正交試驗(yàn)結(jié)果看，最優(yōu)組合為A3B2C1，即氯仿加入量為血溶體積6倍，酸性丙酮加入量為血球蛋白濾液5倍，p H為4．0。由于氯仿加入量影響程度最小，加入量過大給后續(xù)處理帶來困難，也浪費(fèi)試劑增加成本，綜合考慮5倍適宜。從而得出最佳組合條件為，氯仿加入量為血溶體積5倍，酸性丙酮加入量為血球蛋白濾液5倍，p H4～5。

3 討論

3．1 分離血紅蛋白

新鮮牛血中含有大量凝血因子和凝血酶原。在鈣離子存在時(shí)，凝血因子和凝血酶原被激活而發(fā)生作用使血液凝固，影響血細(xì)胞分離。因此，新鮮牛血加入檸檬酸鈉，能使鈣離子沉淀而得到抗凝全血。經(jīng)離心分離得到血細(xì)胞，血細(xì)胞膜破裂或溶解后，就可分離出血紅蛋白。血細(xì)胞與適量水混合后，降低了細(xì)胞外滲透壓，使血細(xì)胞吸水導(dǎo)致細(xì)胞膜脹裂，同時(shí)配以適量的機(jī)械作用，如攪拌或超聲波等，可以提高破裂速度［11］。由于細(xì)胞膜中含有脂蛋白，故凡能使脂類溶解或改變脂類物理性狀的物質(zhì)如氯仿、乙醚等，都能引起膜的脂雙層破壞而溶血。本試驗(yàn)加入一定量氯仿，使血細(xì)胞膜破裂和溶解同時(shí)進(jìn)行，血紅蛋白從血細(xì)胞中較完全地分離出來。

3．2 提取血紅素

血紅蛋白是由4分子亞鐵血紅素和1分子珠蛋白結(jié)合而成。根據(jù)血紅素與珠蛋白的結(jié)合在p H＜3．0時(shí)最為疏松，極易被有機(jī)溶劑提取出來的原理。本試驗(yàn)采用含30 m L／L鹽酸的丙酮溶液提取血紅素，丙酮使蛋白質(zhì)凝固沉淀，同時(shí)血紅素呈溶液狀態(tài)進(jìn)入丙酮相。用抽濾的方法使固液兩相分離，對(duì)液相進(jìn)一步處理得到血紅素?？紤]有機(jī)溶劑狀態(tài)下，p H不易測(cè)定，為使提取液p H保持在3．0左右，加入5倍30 m L／L鹽酸的丙酮溶液。

3．3 綜合利用

提取血紅素用血細(xì)胞為材料，血漿可以做水解蛋白之用，還可以加工制備成血漿蛋白粉。血漿蛋白粉在仔豬料中使用效果良好，尤其在早期斷奶仔豬中使用，效果更是得到廣泛認(rèn)可［12］。牛血提取血紅素后剩余的部分變性蛋白可用做飼料添加劑，還可以進(jìn)一步水解得到氨基酸、多肽和蛋白胨等。

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Study on Technology of Extracting Heme from Qinchuan Cattle Blood

MA Zhi－ke，ZAN Lin－sen，MA Li

（CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China）

Heme extracted from Qinchuan cattle blood was studied．The main factors，namely chloroform added，acid acetone added，p H were chosen to carry on the gradient test，as single factor respectively，to make the range of each single factor．The orthogonal trial of L9（33）was used to select the suitabl combination conditions of extraction．The results showed that the optimum condition for the extraction of heme were：chloroform and blood volume at a ration of 5∶1（V∶V），acid acetone and hemoglobin solution at a ration of 5∶1（V∶V）and p H 4－5．

Qinchuan cattle；heme；extraction technology

Q586

A

1007－5038（2012）06－0084－03

2012－03－01

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（nyhyzx07－035）資助

馬志科（1960－），男，陜西武功人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事教學(xué)實(shí)驗(yàn)及科研工作。＊通訊作者