SD大鼠2型糖尿病模型的建立及相關(guān)指標的測定

陳 嘉，張永斌，桑傳蘭，陳 苑，高 欣，董浩然，曹崇波

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州 510405）

SD大鼠2型糖尿病模型的建立及相關(guān)指標的測定

陳 嘉，張永斌，桑傳蘭，陳 苑，高 欣，董浩然，曹崇波

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州 510405）

通過鏈脲佐菌素（STZ）結(jié)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型。30只健康雄性SD大鼠隨機分為模型組（20只）、空白組（10只）。模型組喂飼高糖高脂飼料4周后，用STZ 30mg／kg一次性左下腹腔注射。檢測試驗第1周、第4周，注射STZ后第1周、第4周、第8周、第12周空腹體重、血清葡萄糖（BG）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、胰島素（INS）、葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（GIP）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）、胰高血糖素樣多肽-1（GLP-1）等指標，進行統(tǒng)計分析。處死大鼠，取胰腺進行病理切片檢查。動物成模率為75%。試驗第4周，模型組TG、TC值明顯升高，與空白組比較，P＜0.01。注射STZ后第1、4、8、12周，模型組BG、TG、TC值均明顯升高，與空白組比較，P＜0.01；ISI均明顯降低，與空白組比較，P＜0.01。注射STZ后第1、4、8周，模型組的 GLP-1、IGF-1值明顯降低，與空白組比較，P＜0.01。注射STZ后第12周，模型組的GLP-1、GIP、IGF-1值明顯降低，與空白組比較，P＜0.01。試驗結(jié)果表明，STZ一次性左下腹腔注射結(jié)合高糖高脂飲食可成功誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型。GIP、IGF-1、GLP-1等細胞因子參與了2型糖尿病的病理發(fā)生。

2型糖尿病；鏈脲佐菌素；動物模型

糖尿病是嚴重危害人類健康的慢性疾病之一，目前全球糖尿病患者超過7億，其中90%為非胰島素依賴型糖尿病，即2型糖尿病。目前，2型糖尿病的發(fā)病機制尚未明確，缺乏長效、安全、依從性高的治療方法。建立一種既符合人類2型糖尿病發(fā)病特點，而又簡單，經(jīng)濟的動物模型是當(dāng)前研究2型糖尿病發(fā)病機制及研發(fā)抗2型糖尿病藥物及治療方法亟待解決的問題。目前國內(nèi)多采用化學(xué)藥物損傷法造模，具有操作簡便，成模率高的特點。鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）是一種較理想的化學(xué)藥物，其對胰島β細胞有特異性殺傷作用，而對其他組織損傷較小，為目前國內(nèi)外制作糖尿病動物模型中較多使用的一種藥物。本試驗通過喂飼高糖高脂飼料加STZ對大鼠進行腹腔注射，建立一種較佳的類似人類2型糖尿病的動物模型。通過動態(tài)觀察動物體重、血糖、血脂、胰島素（insulin，INS）及調(diào)節(jié)胰島素分泌的胃腸道激素變化，包括葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（glucose-dependent insulintropic polypeptide，GIP）、胰 島 素 樣 生 長 因 子 1（insulin-like growthtor-1，IGF-1）、胰高血糖素樣多肽1（gluca-gon-likeptide-1，GLP-1）等，為 SD 大鼠2型糖尿病動物模型的使用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，體重180g～220g，30只，雄性。購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。

1.1.2 試劑 鏈脲佐菌素（STZ）為晶欣生物科技公司產(chǎn)品（LOT：120705）；胰島素ELISA試劑盒（LOT：U28071539）、胰高血糖素樣肽ELISA試劑盒（LOT：V10071540）、糖依賴性胰島素釋放肽ELISA試劑盒（LOT：U28071541）為Cusa Bio Biotech Co.，Ltd公司產(chǎn)品；胰島素樣生長因子1ELISA試劑盒（LOT：NO997106）為博士德生物工程有很公司產(chǎn)品；血糖試紙（穩(wěn)豪型血糖試紙，LOT：3079894）、血糖檢測試劑盒（批號：1010131）、甘油三酯檢測試劑盒（批號：0710111）、總膽固醇檢測試劑盒（批號：0411021）生化檢測試劑均為四川邁克生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 器材設(shè)備 電子血糖分析儀（One Touch Ultra，穩(wěn)豪血糖儀），全自動生化分析儀（7060型），酶標儀為美國Thermo Labsystems公司產(chǎn)品。

1.1.4 飼料 普通飼料及高糖高脂飼料均購于廣州市花都區(qū)花東信華實驗動物養(yǎng)殖場。高糖高脂飼料配方：180g／L 豬油，200g／L 蔗糖，30g／L蛋黃粉，590g／L基本飼料。

1.2 方法

1.2.1 分組 將30只SPF級SD大鼠購回后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，無異常發(fā)現(xiàn)者，隨機分成2組，正常組10只，模型組20只。

1.2.2 動物模型的建立 空白組大鼠予普通飼料，模型組大鼠予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)4周。4周后將模型組大鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射STZ（30 mg／kg）。STZ注射5d后，對注射STZ的大鼠測定尾靜脈隨機血糖，認為隨機血糖＞16.7mmol／L者為2型糖尿病造模成功。

1.2.3 指標的記錄與測定 每日8：00～10：00時對大鼠進行一般狀態(tài)觀察。每周記錄1次體重。大鼠腹腔注射0.6mol／L水合氯醛，眼眶靜脈叢采血，檢測實驗第1周、第4周；注射注射STZ后第1周、4周、8周、12周的空腹血糖（BG）、血清甘油三酯（TG）、血清總膽固醇（TC）、INS、GLP-1、GIP、IGF-1的含量。12周麻醉后處死動物，剝離并摘取胰腺，稱重后置1.33mol／L多聚甲醛溶液中浸泡固定，進行組織形態(tài)學(xué)檢查。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±SD）表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

STZ注射后，有2只大鼠未成模，模型組有3只大鼠死亡。

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)

模型組大鼠出現(xiàn)飲水增多、尿量增多、拉尾排便、排尿、毛松、懶動等癥狀。

2.2 體重情況

喂養(yǎng)4周后，空白組體重321.63g±26.59g，模型組體重346.63g±34.44g，與空白組比較，體重增加，但差異不顯著（P＞0.05）。注射STZ后，模型組相應(yīng)時間點的體重比空白組輕，但差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

2.3 代謝相關(guān)指標

試驗第1周，2個組的BG、TG、TC、INS、胰島素敏感指數(shù)（ISI）比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。試驗第4周，模型組TG、TC值明顯升高，與空白組比較，P＜0.01。注射STZ后第1、4、8、12周，模型組BG、TG、TC值均明顯升高，與空白組比較，P＜0.01；ISI均明顯降低，與空白組比較，P＜0.01（表2）。

表1 兩組大鼠體重比較（±SD，n＝8，單位 ：g）Table 1 Comparison of body weights in rats of two groups（±SD，n＝8，unit：g）

表1 兩組大鼠體重比較（±SD，n＝8，單位 ：g）Table 1 Comparison of body weights in rats of two groups（±SD，n＝8，unit：g）

ection空白組 Blank group 216.63±10.23 321.63±26.59 369.88±54.41 388組別Groups第1周First week第4周Fourth weeks注射STZ第1周First week after STZ injection注射STZ第4周Fourth week after STZ injection注射STZ第8周Eighth week after STZ injection注射STZ第12周Twelfth week after STZ inj.38±39.08 442.25±42.09 555.25±36.25模型組 Model group 209.63±17.49 346.63±34.44 361.25±56.01 368.38±23.35 421.63±57.90 524.50±46.52

表2 兩組大鼠血糖、血脂及胰島素比較（±SD，n＝8）Table 2 Comparison of BG，TC，TG，INS in rats of two groups（±SD，n＝8）

表2 兩組大鼠血糖、血脂及胰島素比較（±SD，n＝8）Table 2 Comparison of BG，TC，TG，INS in rats of two groups（±SD，n＝8）

注：胰島素敏感指數(shù)（ISI）＝ln［1／（FBG×INS）］；與空白組比較，“＊＊”P＜0.01。Note：Insulin sensitivity index（ISI）＝ln［1／（FBG×INS）］；Compared with blank group，“＊＊”P＜0.01.

ISI時間Time組別Groups BG／（mmol·L－1）TC／（mmol·L－1）TG／（mmol·L－1）INS／（μIU·mL－1）第1周 First week 空白組 Blank group 3.9±0.5 1.7±0.3 0.8±0.2 54.4±15.7 －5.31±0.35模型組 Model group 4.0±0.5 1.8±0.3 0.9±0.4 59.2±11.8 －5.44±0.29第4周 Furth week 空白組 Blank group 4.2±1.4 1.6±0.4 0.8±0.2 60.8±22.2 －5.43±0.61模型組 Model group 4.5±0.7 4.6±0.4＊＊ 1.8±0.4＊＊ 59.3±19.8 －5.52±0.38注射STZ第1周 空白組Blank group 4.5±0.8 1.6±0.4 0.9±0.4 60.9±20.2 －5.55±0.40 First week after STZ injection 模型組 Model group 9.3±1.1＊＊ 4.4±2.1＊＊ 2.5±1.2＊＊ 60.5±14.9 －6.30±0.27＊＊注射STZ第4周 空白組Blank group 4.5±0.8 1.5±0.5 0.9±0.4 58.0±14.9 －5.44±0.34 Fourth week after STZ injection 模型組 Model group 25.3±3.7＊＊ 4.0±1.0＊＊ 2.4±0.6＊＊ 53.4±14.0 －7.25±0.31＊＊注射STZ第8周 空白組Blank group 4.4±1.1 2.1±0.4 0.9±0.4 59.0±19.3 －5.51±0.41 Eighth week after STZ injection 模型組 Model group 26.1±2.6＊＊ 4.1±0.6＊＊ 2.4±0.4＊＊ 55.1±15.7 －7.45±0.26＊＊注射STZ第12周 空白組Blank group 4.4±1.1 2.1±0.4 0.9±0.4 59.9±19.9 －5.51±0.41 Twelfth week after STZ injection 模型組 Model group 34.6±5.2＊＊ 4.1±0.9＊＊ 2.7±0.4＊＊ 51.5±10.7 －7.45±0.26＊＊

2.4 胃腸道分泌激素的變化

試驗第1、第4周，2個組的 GIP、GLP-1、IGF-1值比較，差異不顯著（P＞0.05）。注射STZ后第1、4、8周，模型組的 GLP-1、IGF-1值明顯降低，與空白組比較差異顯著，P＜0.01。注射STZ后第12周，模型組的 GLP-1、GIP、IGF-1值明顯降低，與空白組比較差異顯著，P＜0.01（表3）。

表3 兩組大鼠胃腸道分泌激素比較（±SD，n＝8）Table 3 Comparison of gastrointestinal hormones in rats of two groups（±SD，n＝8）

表3 兩組大鼠胃腸道分泌激素比較（±SD，n＝8）Table 3 Comparison of gastrointestinal hormones in rats of two groups（±SD，n＝8）

注：與空白組比較，“＊＊”P＜0.01。Note：Compared with blank group，“＊＊”P＜0.01.

時間 Time 組別 Groups GLP-1／（ng·mL－1） GIP／（ng·mL－1） IGF-1／（ng·mL－1）1.42±0.30 0.84±0.19 311.86±121.47模型組 Model group 1.36±0.30 0.82±0.21 310.51±38.11第4周 Furth week 空白組 Blank group 1.45±0.55 0.84±0.20 301.60±45.17模型組 Model group 1.44±0.17 0.82±0.23 307.29±21.38注射STZ第1周 空白組 Blank group 1.39±0.40 0.83±0.21 306.70±44.67 First week after STZ injection 模型組 Model group 0.81±0.27＊＊ 0.68±0.18 196.55±72.00＊＊注射STZ第4周 空白組 Blank group 1.40±0.63 0.83±0.25 302.42±112.82 Fourth week after STZ injection 模型組 Model group 0.77±0.28＊＊ 0.63±0.26 177.62±70.46＊＊注射STZ第8周 空白組 Blank group 1.30±0.49 0.86±0.26 304.42±108.81 Eighth week after STZ injection 模型組 Model group 0.69±0.24＊＊ 0.75±0.23 131.38±64.85＊＊注射STZ第12周 空白組 Blank group 1.46±0.42 0.81±0.20 309.94±35.76 Twelfth week after STZ injection 模型組 Model group 0.40±0.12＊＊ 0.58±0.19＊ 46.71±9.27第1周First week 空白組Blank group＊＊

2.5 胰腺病理組織學(xué)變化

模型組大鼠的胰腺在病理上與空白組大鼠比較出現(xiàn)了下列改變：胰島體積縮小，細胞數(shù)目減少，間隙增大，出現(xiàn)明顯空泡變性（圖1）。

圖1 大鼠胰腺切片（HE×400）Fig.1 The sections of pancreas in rats（HE×400）

3 討論

建立2型糖尿病動物模型可以通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量STZ損傷胰島功能，引起血糖升高，模擬2型糖尿病的發(fā)病過程［1－3］。既往研究報道中，高糖高脂飼料喂養(yǎng)時間為4周～10周不等，STZ注射劑量為25mg／kg～90 mg／kg［4－7］，高糖高脂飼料喂養(yǎng)時間過長，導(dǎo)致試驗周期過長；STZ劑量偏大，實驗動物胰島β細胞破壞過多，則更傾向于1型糖尿病的表型特點［8］，影響研究結(jié)果，而且死亡率增加。本研究予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射STZ（30mg／kg），5d后，對注射STZ的大鼠測定尾靜脈隨機血糖，認為隨機血糖＞16.7mmol／L者為2型糖尿病造模成功，成模率為75%，與文獻報道的接近［9－12］。以高糖高脂飼料喂飼4周后，模型組TG、TC值開始明顯升高，直至實驗第16周（注射STZ后12周），模型組TG、TC值仍明顯高于空白組。注射STZ后1周～12周，模型組ISI均明顯降低，符合2型糖尿病的特點。病理檢查結(jié)果顯示，模型組大鼠的胰腺胰島體積縮小，細胞數(shù)目減少，間隙增大，出現(xiàn)明顯空泡變性，可能是由于STZ直接破壞胰島β細胞造成的病理變化。

糖尿病的發(fā)生是由各種致病因子作用于機體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的一系列代謝紊亂綜合征?，F(xiàn)已知胃腸道的黏膜上分布有大量的內(nèi)分泌細胞，胃腸內(nèi)分泌細胞和胰腺內(nèi)分泌細胞同APUD系，其分泌的激素可直接影響到胰島的功能，即“腸－胰島軸（enteroinsular axis）”。所謂腸-胰島素軸是指腸道在食物特別是碳水化合物的刺激下通過釋放內(nèi)分泌遞質(zhì)來促使胰島素釋放，而且葡萄糖經(jīng)腸道攝入可以引起比經(jīng)靜脈注射更高的β細胞分泌胰島素反應(yīng)，這種胃腸激素與胰島素分泌之間的關(guān)系稱為“腸－胰島軸”。調(diào)節(jié)胰島素分泌的胃腸道激素包括GIP、IGF，可促使機體產(chǎn)生胰島素抵抗現(xiàn)象；以及酪酪肽（peotide YY，PYY）、GLP-1等，使血糖降低、胰島凋亡的速率減低、顯著促使胰島增殖［13－14］。本研究通過 ELISA 方法檢測了實驗第1周、第4周、注射STZ后第1周、第4周、第8周、第12周血清 GIP、IGF-1、GLP-1含量的變化，初步探討這些胃腸激素與糖尿病形成的關(guān)系。

葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（GIP）是由分布于小腸上段的K細胞在攝入營養(yǎng)后反應(yīng)性分泌的一種重要的分泌素。GIP在動物和人體均能發(fā)揮葡萄糖依賴的促胰島素分泌作用，尤其對早期相胰島素分泌更為重要。另外，GIP還能促進胰島β細胞的增殖和存活。本試驗觀察到試驗的早期，模型組大鼠血清的GIP含量與空白大鼠比較，無明顯差異，但隨著時間的推移，模型組大鼠血清的GIP含量有逐漸下降的趨勢，但與空白組比較仍無明顯差異。直至注射STZ后第12周，模型組大鼠血清的GIP含量明顯低于空白組，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示GIP在2型糖尿病發(fā)病機制中起了一定的作用。

胰島素樣生長因子1（IGF-1）具有促進生長發(fā)育、促進物質(zhì)代謝以及免疫調(diào)節(jié)等作用。研究表明，2型糖尿病患者IGF-1水平下降，IGF-1與胰島素抵抗指數(shù)呈負相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，注射STZ后第1周，模型組大鼠血清IGF-1明顯下降，而且隨著時間的推移，有逐漸下降的趨勢，與胰島素敏感性指數(shù)呈正相關(guān)，與文獻報道相符［15］。

胰高血糖素樣多肽1（GLP-1）是一種生理性肽類腸道激素，主要由回腸末端、結(jié)腸和直腸中的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞L細胞分泌。GLP-1與胰島β細胞上特異性的受體結(jié)合后，具有刺激胰島素分泌，提高β細胞對葡萄糖的敏感性，刺激β細胞中胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，注射STZ后第1周，模型組大鼠血清GLP-1明顯下降，而且隨著時間的推移，有逐漸下降的趨勢，提示GLP-1在2型糖尿病發(fā)病機制中也起了一定的作用。

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Establishment of SD Rat Model of Type 2 Diabetes Mellitus and Detection of Related Indexes

CHEN Jia，ZHANG Yong-bin，SANG Chuan-lan，CHEN Yuan，GAO Xin，DONG Hao-ran，CAO Chong-bo

（GuangzhouUniversityofChineseMedicine，LaboratoryAnimalCenter，Guangzhou，Guangdong，510405，China）

In order to establish a rat model of type 2diabetes mellitus（T2DM）induced by streptozotocin（STZ）in combination with high-sugar and high-fat diets，30healthy male SD rats were randomly divided into the T2DM model group（20rats）and the blank group（10rats）.STZ（30mg／kg）was injected into rats in the T2DM model group.Rats in the T2DM model group were fed with high-sugar and high-fat diets for 4weeks.The fasting blood glucose（BG），blood triglyceride（TG），blood cholesterol（TC），body weight，fasting insulin（INS），glucose dependent insulinotropic releasing peptide（GIP），insulin-like growth factor-1（IGF-1），glucagon like peptide-1（GLP-1）were detected in first week，fourth week and after first week，fourth week，eighth week，twelfth week after STZ injection.The sections of pancreas were detected by histopathological examination.The success rate was 75%.Values of TG，TC in T2DM model group increased significantly than those in blank group（P＜0.01）after 4 weeks.Values of BG，TG，TC in T2DM model group increased significantly than those in blank group（P＜0.01）1，4，8，12weeks after injection of STZ；ISI decreased significantly than those in blank group，P＜0.01；values of GLP-1，IGF-1in T2DM model group decreased significantly than those in blank group（P＜0.01）1，4，8weeks after injection of STZ；values of GLP-1，IGF-1，GIP in T2DM model group decreased significantly than those in blank group（P＜0.01）12weeks after injection of STZ.The method of inducing T2DM by high-sugar and high-fat diet with STZ injection was effective.GIP，IGF-1，GLP-1involved in the pathogenesis of type 2diabetes mellitus.

type 2diabetes mellitus；streptozotocin；animal model

S852.3

A

1007-5038（2012）06-0091-05

2012-03-22

廣東省科技計劃項目（粵科規(guī)劃字［2010］138號；2010B060500013）；廣東省科技計劃項目（粵科規(guī)劃字［2011］71；2011B060300007）

陳 嘉（1975－），女，廣西北海人，副研究員，主要從事實驗動物學(xué)研究。＊通訊作者