肺炎支原體P1蛋白羧基端基因片段的克隆及原核表達(dá)

王云龍，劉小聰，李玉林，王國強(qiáng)，孫新城，董彩文，程 蕾，王繼創(chuàng)，鄧?yán)枥?，李恒?/p>

（1．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)450003；2．鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450121；3．河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001）

肺炎支原體P1蛋白羧基端基因片段的克隆及原核表達(dá)

王云龍1，2，劉小聰1，李玉林3，王國強(qiáng)3，孫新城3，董彩文3，程 蕾3，王繼創(chuàng)3，鄧?yán)枥?，李恒思3

（1．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)450003；2．鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450121；3．河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001）

根據(jù)GenBank公布的肺炎支原體（Mycoplasmapneumoniae，Mp）P1蛋白羧基端序列（AF290001．1），設(shè)計合成2對特異性引物，采取套式PCR方法，以肺炎支原體培養(yǎng)物中提取的DNA為模板，擴(kuò)增肺炎支原體P1蛋白羧基端基因序列，將其克隆至p ET32a表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32a／P1（3 802～4 695），轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21－gold，測序驗證后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS－PAGE表明重組蛋白表觀分子質(zhì)量與預(yù)期一致，可溶性表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot證實重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。

肺炎支原體；P1蛋白；套式PCR；原核表達(dá)

肺炎支原體（Mycoplasmapneumoniae，Mp）是引起人類原發(fā)性肺炎的常見病原體之一。Mp感染廣泛存在，寒冷季節(jié)發(fā)病率較高，每4年～5年可引起一次地區(qū)性暴發(fā)流行［1］。Mp感染以兒童多見，據(jù)文獻(xiàn)報道我國Mp感染率在流行高峰期可達(dá)33%～38%［2－4］。除呼吸道急性感染癥狀外，亦可誘發(fā)哮喘、阻塞性肺疾病的急性發(fā)作及導(dǎo)致心血管、血液、中樞神經(jīng)等多系統(tǒng)損害［5－6］，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，不利于診斷。因此，建立早期、快速的診斷方法對指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

Mp感染的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究顯示，位于黏附細(xì)胞器頂端表面的P1黏附蛋白是其主要功能結(jié)構(gòu)，含有多個抗原決定簇，可激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)［7］。但作為制備 Mp診斷試劑盒的候選蛋白，P1黏附蛋白結(jié)構(gòu)與生殖道支原體、真核生物結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)存在一定相似性，以完整的Pl黏附蛋白制備診斷試劑時，可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)。國外學(xué)者對其進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在P1黏附蛋白結(jié)構(gòu)中與黏附有關(guān)的區(qū)域及特異的Mp P1黏附蛋白抗原決定簇主要位于羧基端［8］。因此，可選擇該亞單位用于制備Mp診斷試劑。

本試驗根據(jù)GenBank中肺炎支原體的基因序列設(shè)計引物，采用套式PCR方法擴(kuò)增P1蛋白羧基端序列，并對其進(jìn)行序列分析及原核表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化和生物活性鑒定后，可用于檢測方法的建立，并為基因工程疫苗的研究提供新的途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 肺炎支原體培養(yǎng)物、菌株與載體 克隆菌Top10F＇、表達(dá)載體p ET32a及表達(dá)菌BL21－gold為河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1．1．2 主要試劑 DNA提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；Taq酶、D2000 DNA Marker、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI及T4連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Biowest公司原裝；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．1．3 肺炎支原體陽性血清 為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1．2 方法

1．2．1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的人肺炎支原體P1蛋白羧基端基因序列（AF290001．1），參考黃勁松［9］和趙芝娜［10］的肺炎支原體P1蛋白羧基端基因特異引物，對引物進(jìn)行重新設(shè)計，合成2對特異性引物P1／P2和P3／P4。

其中，P1／P2為外引物，P3／P4為內(nèi)引物，采用套式PCR方法，最終擴(kuò)增片段為894 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．2．2 肺炎支原體基因組的提取 按照試劑盒說明書操作。

1．2．3 P1黏附蛋白羧基端序列的擴(kuò)增 第1次PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為30μL：TaqDNA聚合酶 0．4μL，20 倍緩沖液 1．5μL，Mg2＋（50 mmol／L）0．6μL，d NTP（10 mmol／L）0．5μL，P1／P2引物 （10 pmol／L ）各 0．5μL，模板 （基因組DNA）2μL，去離子水補(bǔ)足30μL。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃1 min，58℃1 min，72℃1．5 min，35個循環(huán)；72℃5 min。第2次PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為30μL：TaqDNA聚合酶0．4μL，20倍緩沖液1．5μL，Mg2＋（50 mmol／L）0．6μL，d NTP（10 mmol／L）0．5μL，P3／P4引物（10 pmol／L）各0．5 μL，第一次擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，去離子水補(bǔ)足30μL。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1．5 min，35個循環(huán)；72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后于10 g／L瓊脂糖凝膠上電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1．2．4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用DNA回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收的片段和載體p ET32a同時進(jìn)行BamH I、XhoI雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化E．coilTop10F＇感受態(tài)細(xì)胞。重組菌經(jīng)培養(yǎng)后提質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR及BamH I、XhoI雙酶切鑒定為陽性者轉(zhuǎn)化BL21－gold感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，以確定目的片段序列及插入位置的正確性。測序結(jié)果與GenBank公布的序列進(jìn)行對比，若鑒定正確，命名重組質(zhì)粒為p ET32a／P1（3802～4695）。

1．2．5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及 SDS－PAGE分析 取鑒定正確的菌液活化過夜，平行接種至2支3．5 m L的LB培養(yǎng)基（含氨芐西林）中，37℃培養(yǎng)至OD600 nm為0．6時，取其中一支用終濃度為0．1 mmol／L的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，另一支做對照。4 h后每支各取1 m L菌液制蛋白樣，進(jìn)行SDSPAGE。

樣品處理方法：取1 m L菌液于離心管中，12 000 r／min離心2 min，棄上清，100μL PB（p H 7．6，0．05 mol／L）懸菌，超聲波破碎后12 000 r／min離心2 min，分離上清和沉淀。取30μL上清加入等體積2×SDS上樣緩沖液，沉淀中加30μL PB（p H7．6，0．05 mol／L）混勻后加入等體積2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，分別制成上清和沉淀的蛋白樣品。取上述蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE，鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量，分析蛋白可溶性。

1．2．6 重組蛋白的 Western blot鑒定 取上述重組融合蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE，同時設(shè)空質(zhì)粒對照。以恒定電流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用PBST清洗5次后以10 m L／L BSA封閉2 h；加入人肺炎支原體抗體陽性血清，37℃溫育1．5 h，PBST洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG，37℃溫育2 h，清洗后加入DAB顯色液顯色，待出現(xiàn)條帶后立即用PBST終止顯色，觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2．1 P1蛋白羧基端基因的擴(kuò)增

電泳結(jié)果顯示，第一次擴(kuò)增得到了一條1 044 bp的條帶，第二次擴(kuò)增得到了一條約894 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

圖1 Mp P1蛋白羧基端基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 PCR identification of C－terminal gene fragment of Mp P1

2．2 p ET32a／P1（3 802～4 695）重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒PET32a／P1（3 802～4 695）經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切得到約894 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。

2．3 P1蛋白羧基端基因的測序鑒定

測序結(jié)果與已公布P1黏附蛋白羧基端核苷酸序列（AF290001．1）一致性為99．54%，氨基酸序列一致性為100%。

2．4 重組蛋白SDS－PAGE分析

重組菌在37℃條件下，經(jīng)終濃度為0．1 mmol／L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，超聲破碎提取蛋，白大小約為50 ku，與預(yù)期結(jié)果相符。電泳結(jié)果顯示重組蛋白呈可溶性表達(dá)（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒p ET32a／P1（3 802～4 695）雙酶切鑒定Fig．2 Identification of p ET32a／P1（3 802－4 695）by restriction enzyme digestion

圖3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig．3 SDS－PAGE analysis of expression products of BL21－gold／pET32a／P1

2．5 重組蛋白的免疫反應(yīng)性檢測

用肺炎支原體抗體陽性血清檢測重組蛋白的免疫原性，顯色后在硝酸纖維膜上出現(xiàn)單一條帶（圖4）。

2．6 表達(dá)產(chǎn)物純化

目的蛋白分子質(zhì)量約為32 ku，帶有 His－tag、STag和Trx－tag標(biāo)簽的融合蛋白分子為可溶性蛋白，蛋白分子質(zhì)量為50 ku左右，與預(yù)期相符，Ni2＋親合層析純化后進(jìn)行SDS－PAGE分析，凝膠掃描顯示純度達(dá)90%以上（圖5）。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig．4 Analysis of expressed products by Western blot

圖5 SDS－PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果Fig．5 SDS－PAGE analysis of purifid expressed products

3 討論

肺炎支原體是原發(fā)性肺炎的病原體。感染后以持續(xù)性劇烈干咳為主要臨床表現(xiàn)，癥狀不典型，很難與細(xì)菌、病毒所致呼吸道感染相區(qū)別。除呼吸系統(tǒng)癥狀往外，Mp感染尚能誘發(fā)肺外并發(fā)癥，如心絞痛、腎炎、肺炎支原體腦炎、溶血性貧血、皮疹、關(guān)節(jié)炎等［11］，癥狀復(fù)雜，不利于診斷。為避免延誤治療，建立快速、早期、準(zhǔn)確的診斷方法尤為重要［12］。

免疫學(xué)研究證實黏附是Mp致病的關(guān)鍵步驟，已有的研究表明P1蛋白羧基端是肺炎支原體的主要黏附區(qū)，含有較多的P1蛋白抗原決定簇［13］。黃勁松等［9］對不同亞型的 Mp進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這段基因片段在不同亞型的Mp中同源性100%。因此P1蛋白羧基端是制備基因工程疫苗和快速診斷試劑盒的理想材料。

為提高PCR的靈敏度和特異性，本試驗采用套式PCR方法，不僅可提高擴(kuò)增倍數(shù)從而提高PCR敏感性，還可通過二次擴(kuò)增降低非特異性反應(yīng)。測序結(jié)果表明該片段長度為894 bp，編碼298個氨基酸。Western blot表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性，為下一步研發(fā)疫苗及制備快速檢測試劑奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of C－terminal Gene Fragment of P1 Protein ofMycoplasmapneumonia

WANG Yun－long1，2，LIU Xiao－cong1，LI Yu－lin3，WANG Guo－qiang3，SUN Xin－cheng3，DONG Cai－wen3，CHENG Lei3，WANG Ji－chuang3，DENG Li－li3，LI Heng－si3

（1．XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang，Henan，450003，China；2．ZhengzhouTechnicalCollege，Zhengzhou，Henan，450121，China；3．HenanBiotechnologyResearchCenter，Zhengzhou，Henan，450001，China）

According to the published nucletide sequence of C－terminal gene fragment of P1 protein ofMycoplasmapneumoniain GenBank（AF290001．1），2 pairs of specific primers were designed and the total DNA was extracted from Mp．The fragment amplified by nested PCR was cloned into prokaryotic expression vector pET－32a and transformed into BL21－gold．After the recombinant plasmid pET32a／P1（3 802－4 695）was sequenced and compared with other strains in GenBank，it was induced by IPTG．The recombinant protein was identified by SDS－PAGE and Western blot．SDS－PAGE analysis revealed that the expressed protein was identical to C－terminal gene fragment of P1 protein in molecular weight，Western－blot showed that the expressed protein can be recognized byMycoplasmapneumoniapositive serum．

Mycoplasmapneumonia；P1 protein；nested PCR；prokaryotic expression

S852．62

A

1007－5038（2012）06－0045－04

2012－02－16

王云龍（1962－），男，河南孟津人，教授，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。