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    產(chǎn)蛋下降綜合征病毒纖突蛋白Knob-S區(qū)原核表達(dá)及其活性分析

    2012-01-27 06:57:00唐應(yīng)華陸吉虎何家惠黎滿香侯繼波
    關(guān)鍵詞:原核血凝質(zhì)粒

    陳 滔,唐應(yīng)華,陸吉虎,高 峰,于 漾,何家惠,黎滿香,侯繼波*

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128;2.江蘇省農(nóng)科院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇南京210014)

    產(chǎn)蛋下降綜合征病毒纖突蛋白Knob-S區(qū)原核表達(dá)及其活性分析

    陳 滔1,2,唐應(yīng)華2,陸吉虎2,高 峰1,2,于 漾2,何家惠2,黎滿香1*,侯繼波2*

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128;2.江蘇省農(nóng)科院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇南京210014)

    通過PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)纖突蛋白Knob-S區(qū)基因,將其克隆至原核表達(dá)載體p ET-32(a)的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建了原核表達(dá)載體p ET-32(a)-Knob-S,將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE分析,結(jié)果獲得了42 ku的融合蛋白,用純化的融合蛋白免疫雞制備抗血清,通過血凝試驗(yàn)、Western blot和血凝抑制試驗(yàn)分析,表明該融合蛋白不能凝集雞紅細(xì)胞,無血凝活性;但可與EDSV陽性血清發(fā)生特異反應(yīng),并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,具有很好的抗原性。

    產(chǎn)蛋下降綜合征病毒;原核表達(dá);Knob-S區(qū)

    減蛋綜合征(Egg drop syndrome,EDS-76)是由腺病毒引起的一類以產(chǎn)蛋率下降,產(chǎn)軟殼蛋為特征的急性傳染病,分類上屬于富AT腺病毒屬(Atadenovirus)鴨腺病毒A型。由11種大小從14 ku到97 ku不等的蛋白組成[1],纖突蛋白位于病毒基因組的L5區(qū),全長1 758 bp,編碼585個(gè)氨基酸,有3個(gè)典型結(jié)構(gòu)域[2],即tail(1~35)、shaft(36~436)、knob(437~585),而位于C末端的Knob區(qū)在病毒感染過程中起吸附宿主細(xì)胞的作用[3],tail區(qū)在空間上與五鄰體基座緊密相連,EDSV的每個(gè)五鄰體基座上只連接一個(gè)纖突蛋白[4]。

    本試驗(yàn)通過對EDSV纖突蛋白Knob-S區(qū)及相鄰shaft區(qū)34個(gè)氨基酸進(jìn)行原核表達(dá)、純化及抗原分析,并對純化的Knob-S蛋白進(jìn)行活性鑒定,用其作為抗原對動(dòng)物進(jìn)行免疫,檢測誘導(dǎo)的抗體是否具有血凝作用,為研究產(chǎn)蛋下降綜合征的診斷抗原和基因工程苗的候選蛋白奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 毒種、菌株和非免疫雞 EDSV-127國際標(biāo)準(zhǔn)毒株;E.coli菌株 DH5α、BL21、pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存;6周齡非免雞購自江蘇某種雞場。

    1.1.2 試劑 質(zhì)粒pMD18T、各種酶、DNA Marker、瓊脂膠回收試劑盒、蛋白Marker等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;抗雞EDSV高免血清由本實(shí)驗(yàn)室保存;羊抗雞酶標(biāo)二抗為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;PVDF膜為聯(lián)科生物有限公司產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 目的基因的獲得 引物設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]以及 NCBI(基因號(hào) Z86065.1)上發(fā)表的EDSV-127纖突蛋白序列,設(shè)計(jì)一對引物用于擴(kuò)增Knob-S區(qū),于上下游引物分別加入BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn),下劃線部分為酶切位點(diǎn),上游引物:5′–TAAGGATCCATGTTGACTTTGGCTTATGATTCCAC–3′,下游引物:5′– CAGAAGCTTGCTACTGTGCTCCAACATATG –3′,擴(kuò)增片段長708bp,引物由金斯瑞生物科技公司合成。

    采用蛋白酶K消化法提取EDSV基因組DNA,并將其做為PCR擴(kuò)增模版。PCR的循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5min;94℃45s,57℃45s,72℃45s,共30個(gè)循環(huán);72℃10min,4℃結(jié)束反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

    1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物加入制備的感受態(tài)細(xì)胞中用熱休克法轉(zhuǎn)化,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒。將上述轉(zhuǎn)化的重組菌培養(yǎng)后,堿裂解法提取質(zhì)粒,對提取的質(zhì)粒采用PCR和酶切方法鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒送美吉測序部測序。序列正確的質(zhì)粒和pET-32(a)同時(shí)用BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切,構(gòu)建重組表達(dá)載體,并命名為pET-32(a)-Knob-S。

    1.2.3 外源蛋白于E.coliBL21中表達(dá)、純化和抗血清的制備 將重組的E.coliBL21接種于LB液體培養(yǎng)基中,加入1mmol/L IPTG(異丙基-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體超聲破碎,取沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳,明確蛋白是否表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件,對重組細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng),采用Ni2+離子親和層析純化重組蛋白。純化后的融合蛋白制備成油包水疫苗免疫雞,三免后采血制備血清備用。

    1.2.4 重組蛋白與雞紅細(xì)胞的血凝試驗(yàn) 在96孔V形微量反應(yīng)板中每孔加入PBS 25μL,左側(cè)第一孔加入純化蛋白25μL,依次倍比稀釋至倒數(shù)第二孔,棄去25μL,加入10mL/L的雞紅細(xì)胞,室溫放置30min,觀察結(jié)果。

    1.2.5 Western blot分析 將純化的蛋白樣品經(jīng)100mL/L SDS-PAGE電泳后,采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,50g/L脫脂乳封閉過夜,然后加入以1∶100稀釋的EDSV高免血清,二抗為HRP標(biāo)記羊抗雞IgG,孵育1h,DAB顯色。

    1.2.6 雞抗Knob-S蛋白陽性血清與雞紅細(xì)胞的血凝抑制試驗(yàn) 根據(jù)EDSV的血凝價(jià),配制4個(gè)血凝單位的病毒液。在96孔V形微量反應(yīng)板中,每孔加入PBS 25μL,第1孔加入雞抗Knob-S蛋白陽性血清25μL,依次倍比稀釋至每10孔,棄去25 μL,加入4單位病毒至倒數(shù)第2孔,室溫作用30 min,最后一孔補(bǔ)25μL PBS,加入10mL/L的紅細(xì)胞,室溫放置30min后,觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

    利用設(shè)計(jì)的引物,通過PCR反應(yīng),擴(kuò)增得到了708bp的目的片段,與預(yù)期的結(jié)果相符,電泳結(jié)果見圖1。

    圖1 EDSV纖突蛋白Knob-S基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of EDSV fiber Knob-S gene

    2.2 重組質(zhì)粒pET-32(a)-Knob-S的鑒定

    重組質(zhì)粒pET-32(a)-Knob-S經(jīng) PCR 和BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后,進(jìn)行瓊脂糖電泳,可見插入片段與目的大小相符,得到708bp和5 900bp的2個(gè)片段(圖2和圖3)。

    2.3 重組蛋白表達(dá)分析和純化

    將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的重組表達(dá)菌BL21/pET-32(a)-Knob-S 進(jìn) 行 SDS-PAGE 分析,結(jié)果顯示,BL21/pET-32(a)-Knob-S在誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前多表達(dá)了分子質(zhì)量約42ku的蛋白(圖4),且該重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)。

    圖2 重組質(zhì)粒p ET-32(a)-Knob-S的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification result of recombinant plasmid p ET-32(a)-Knob-S by PCR

    圖3 重組質(zhì)粒p ET-32(a)-Knob-S酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32(a)-Knob-S by enzyme digestion

    2.4 重組Knob-S蛋白的活性分析

    表達(dá)的重組Knob-S經(jīng)純化并復(fù)性后不能與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集,說明重組蛋白無血凝活性。利用全病毒免疫制備的高免血清與重組Knob-S蛋白進(jìn)行Western blot分析,在42 ku處出現(xiàn)清晰的印跡帶,而不與其他雜蛋白反應(yīng)(圖4),表明重組蛋白有很好的反應(yīng)活性。將該重組蛋白制備成油包水苗后免疫雞,三免后采血HI檢測抗體效價(jià)為1∶512,說明重組蛋白免疫原性亦很好。

    3 討論

    纖突蛋白是EDSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,它與五鄰體和六鄰體一起構(gòu)成病毒衣殼,決定病毒大小,五鄰體蛋白在腺病毒的內(nèi)化過程中起重要作用[6-7],六鄰體主要是帶有屬和亞屬的特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇,還與病毒的型特異性有關(guān)[8-9],國內(nèi)外學(xué)者對這兩種蛋白的表達(dá)研究較多,纖突蛋白的Knob區(qū)不但可識(shí)別宿主細(xì)胞受體而且能增強(qiáng)病毒的吸附,若病毒的Knob區(qū)遭到破壞,即可阻止病毒的感染[5-10],因而,用 EDSV 纖突蛋白Knob-S區(qū)作為免疫原,研究其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效抗體來阻止病毒感染是可行的。為保證Knob區(qū)構(gòu)象的正確性所以加入了鄰近shaft區(qū)的34個(gè)氨基酸。本試驗(yàn)通過PCR方法擴(kuò)增EDSV AV-127國際標(biāo)準(zhǔn)株Knob-S區(qū)基因,構(gòu)建了原核表達(dá)載體p ET-32a-Knob-S,在大腸埃希菌中實(shí) 現(xiàn)了 高效表達(dá),通過血凝試驗(yàn)、Western blot和血凝抑制試驗(yàn)對其抗原性進(jìn)行了分析。

    圖4 重組大腸埃希菌BL21表達(dá)EDSV Knob-S重組蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western-blot analysis of expression of recombinant EDSV Knob-S protein in E.coil BL21

    對純化并復(fù)性的重組蛋白進(jìn)行血凝,結(jié)果發(fā)現(xiàn),并無血凝活性,分析原因,可能是本試驗(yàn)采用的是大腸桿菌的高效表達(dá),雖然對表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行了優(yōu)化,但仍然以包涵體的形式表達(dá),而在表達(dá)的過程中蛋白不能正確折疊和修飾,無法形成與天然蛋白一致的構(gòu)象導(dǎo)致重組蛋白的活性偏低[11-12],另外重組蛋白在復(fù)性純化過程中損失較大,使最終獲得的蛋白含量較低,這可能是影響試驗(yàn)結(jié)果的另一個(gè)原因[13]。

    在本試驗(yàn)中,純化的Knob-S蛋白電泳后轉(zhuǎn)到PVDF后進(jìn)行Western blot,結(jié)果表明,重組蛋白能與抗雞的EDSV陽性血清發(fā)生反應(yīng),并出現(xiàn)清晰的蛋白印跡,而不與陰性血清反應(yīng),說明表達(dá)的蛋白有很好的特異性和反應(yīng)活性。以重組蛋白免疫雞制得的抗血清可抑制EDSV的血凝性,并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很高的血凝價(jià),說明Knob-S蛋白可以作為診斷抗原和基因工程疫苗的候選蛋白。

    [1] Nazerian K,Lee L F,Payne W S.Structural polypeptides of type II avian adenoviruses analyzed by monoclonal and polyclonal antibodies[J].Avian Dis,1991,35(3):572-578.

    [2] Pitcovski J,F(xiàn)ingerut E,Gallili G,et al.A subunit vaccine against hemorrhagic enteritis adenovirus[J].Vaccine,2005,23:4697-4702.

    [3] Wang H J,Li Z Y,Yumul R,et al.Multimerization of adenovirus serotype 3 fiber Knob domains is required for efficient binding of virus to desmoglein 2 and subsequent opening of epithelial junctions[J].Virology,2011,85(13):6390-6402.

    [4] Lynda J.Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 ber protein expressed inE.coli[J].Virology,1994,68(8):5239-5246.

    [5] Fingerut E,Gutter B,Gallili G,et al.A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein[J].Vaccine,2003,21:2761–2766.

    [6] Lindert S,Silvestry M,Mullen T M,et al.Cryo-electron microscopy structure of an adenovirus-integrin complex indicates conformational changes in both penton base and integrin[J].Virology,2009,83(22):11491-11501.

    [7] Christopher M.Computational analysis of human adenovirus type 22 provides evidence for recombination among species D human adenoviruses in the penton base gene[J].Virology,2009,83(17):8980-8985.

    [8] Bradley R R.Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection[J].Virology,2012,86(1):625-629.

    [9] Zandvliet M L.Combined CD8+and CD4+adenovirus hexon specific T cells associated with viral clearance after stem cell transplantation as treatment for adenovirus infection[J].Haematologica,2010,95(11):1943-1951.

    [10] Gutter B,F(xiàn)ingerut E,Gallili G.Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offers an alternative to virus propagation in duck eggs[J].Avian Pathol,2008,37(1):33-37.

    [11] 李向濤,施開創(chuàng),陳宏備,等.豬腦心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表達(dá)及鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(2):6-9.

    [12] 娜仁高娃,呼和巴特爾,王文龍.牛皮蠅幼蟲抗原基因原核表達(dá)條件的優(yōu)化[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(3):32-36

    [13] 楊 華,劉曉民,于志丹,等.減蛋綜合征病毒五鄰體基因的原核表達(dá)及其表達(dá)蛋白的部分活性分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(7):688-691.

    Prokaryotic Expression of Egg Drop Syndrome Virus Knob-S and Its Activity Analysis

    CHEN Tao1,2,TANG Ying-h(huán)ua2,LU Ji-h(huán)u2,GAO Feng1,2,YU Yang2,HE Jia-h(huán)ui2,LI Man-xiang1,HOU Ji-bo2

    (1.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha,Hunan,410128,China;
    2.JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,NationalVeterinaryBiologicalMedicineEngineeringResearchCenter,Nanjing,Jiangsu,210014,China)

    The Knob-S gene of egg drop syndrome virus(EDSV)was amplified by PCR,and then cloned into the polyclonal sites of p ET-32(a)vector.The recombinant prokaryotic expression plasmid was constructed,and named p ET-32(a)-Knob-S.The recombinant plasmid was transformed into competent cells BL21 for expression and induced with IPTG.The fusion protein of 42 ku was expressed.Chickens were immunized with the purified fusion protein to prepare polyclonal anti EDSV serum.The hemagglutination test showed that protein could not agglutinate chicken erythrocytes.Western blot test and hemagglutination inhibition test indicated that the expressed protein had good antigenicity.

    EDSV;prokaryotic expression;Knob-S

    S852.659.1

    A

    1007-5038(2012)06-0041-04

    2012-02-15

    江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目(cx(10)450;cx(11)4072;cx(10)216)

    陳 滔(1985-),男,湖南澧縣人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物傳染病的診斷與預(yù)防。*通訊作者

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