靜脈移植和動員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對胰腺炎肝腎功能損害的保護作用

沈偉敏 陸 貝 封光華

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)胰外器官損傷中急性肝腎功能損害較常見，常并發(fā)多器官功能不全綜合征(MODS)。近年國內(nèi)外研究資料表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell， MSC)可參與多種組織器官損傷的修復(fù)。本研究用靜脈移植和骨髓動員兩種途徑觀察MSC對SAP大鼠病死率、炎癥介質(zhì)、肝腎細(xì)胞功能及凋亡的影響，推測相關(guān)機制。

材料與方法

1.材料:240只雄性SD大鼠，體重270～330g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。L－精氨酸、戊巴比妥鈉購自Sigma公司，Bax、Bcl－2抗體購自Santa公司，TUNEL試劑盒購自Takara公司，粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating Factor，G－CSF)購自齊魯制藥有限公司。

2.方法:(1)實驗分組與建模方法:240只SD大鼠按隨機數(shù)字表法進(jìn)入對照組、SAP模型組、MSC組、G－CSF組及MSC +G－CSF組，各組再按SAP后12、24、48、72h隨機分為4個亞組。大鼠禁食12h，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(0.2ml/ 100g)，麻醉成功后建立股靜脈通道，間隔1h腹腔注射20g/L的L－精氨酸2.0g/kg兩次。MSC組制模SAP成功后6h股靜脈注入自體MSC液1.2ml，G－CSF提前3天注射G－CSF液40μg/(kg·d)，MSC+G－CSF組兼使用MSC和G－CSF液，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。MSC采集:股骨穿刺抽取骨髓，1000r/min離心10min，PBS液離心3次，細(xì)胞沉淀液2500r/min離心30min，收集單核細(xì)胞層，PBS洗滌2次鋪板培養(yǎng)，與造血細(xì)胞分離［1］。(2)病死率及肝、腎病理變化:觀察各組對應(yīng)時間的病死率(死亡數(shù)/總數(shù)×100%)。解剖觀察大鼠肝臟和腎臟大體及光鏡下的病理改變。(3)血清肝腎功能ALT、AST、Bun、Cr、LDH和炎癥因子TNF－α、IL－6、CRP水平的檢測:由全自動生化分析儀操作完成，具體操作參照試劑盒說明書。(4)肝腎細(xì)胞凋亡指數(shù):對肝臟和腎小管切片行TUNEL染色，400倍鏡下觀察凋亡細(xì)胞的分布，計算凋亡指數(shù)AI(視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%)。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，總的比較用方差分析，組間比較用q檢驗，生存情況比較用精確概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.各組大鼠病死情況比較:假手術(shù)組大鼠全部存活，SAP模型組48h 11只、72h 8只。MSC組、GCSF組和聯(lián)合組48h前未見大鼠死亡，72h分別存活為11只、10只和11只，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.各組大鼠肝腎組織病理改變情況:對照組肝臟、腎臟大體無明顯改變;鏡下肝、腎細(xì)胞形態(tài)正常，少量炎性細(xì)胞浸潤;SAP模型組大體肝臟12h色澤晦暗，24h后淤血，散在灰色壞死灶;腎臟12h開始充血水腫，顏色加深，24h后可見散在灰色或紫色斑塊。鏡下肝臟12h有炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞局灶壞死、出血;腎小球12h可見腫脹、淤血，腎小管上皮水腫變性，管腔變窄或閉塞，偶見腎小管上皮壞死，腎間質(zhì)水腫，散在炎癥細(xì)胞浸潤，隨時間延長逐漸加重，出現(xiàn)片狀或大片狀壞死;治療組細(xì)胞變化與模型組比較有減輕。

3.各組肝、腎細(xì)胞凋亡指數(shù)比較:各治療組12h/ 24h后凋亡指數(shù)均較模型組有明顯下降(P＜0.05)，其中MSC+G－CSF組部分時間點與MSC組和GCSF組比較差異顯著(P＜0.05)(表1)。

表1 各組肝、腎細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s，n=12)

表1 各組肝、腎細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s，n=12)

與SAP模型組比較，*P＜0.05;與MSC組比較，#P＜0.05;與G－CSF組比較，△P＜0.05

分組凋亡指數(shù)(AI) 12h 24h 48h 72h *對照組 肝32.2±2.3* 32.1±2.2* 31.8±2.3* 32.1±2.0腎SAP模型組MSC組1.25±0.3* 1.20±0.2* 1.30±0.5* 1.31±0.3*肝93.6±6.3 142.5±8.4 209.8±9.3 226.1±9.5腎12.65±2.3 19.51±3.0 28.83±4.3 35.10±5.5肝89.2±6.1 116.4±7.6* 126.8±7.7* 135.5±9.8*腎G－CSF組MSC+ G－CSF 組6.20±1.5* 11.40±2.6* 16.80±2.7* 17.50±2.8*肝88.7±6.5 120.2±7.8* 127.1±8.2* 133.3±10.2*腎6.41±1.6* 10.82±2.5* 17.23±2.7* 17.14±2.7*肝88.5±7.0 112.4±7.5＊△ 107.1±7.0*#△ 110.3±8.6*#△腎5.80±1.5* 8.40±1.8*#△ 10.10±2.0*#△ 12.30±2.4*#△

4.各組大鼠血清學(xué)檢測指標(biāo):治療組ALT、AST、BUN、Cr、LDH、TNF－α、IL－6、CRP等指標(biāo)與SAP模型組比較，有不同程度下降，聯(lián)合組各指標(biāo)下降趨勢明顯。隨時間延長，聯(lián)合組與干細(xì)胞移植組、G－CSF組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。干細(xì)胞移植組和G－CSF組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

討論

MSC可誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，參與組織器官的生理更新和病理損傷修復(fù)［2～4］。研究發(fā)現(xiàn)外源性MSC能夠定居于腎臟并且分化為腎臟細(xì)胞，如Kale等［5］證實MSC移植可顯著降低血清尿素氮水平，促進(jìn)腎功能恢復(fù)。Ito等［6］研究表明MSC可參與抗Thy1腎小球腎炎模型鼠的腎小球修復(fù)。也有文獻(xiàn)報道MSC腎臟保護作用可能主要是通過旁分泌途徑或發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)途徑實現(xiàn)的［7～10］。同樣，MSC在體內(nèi)外可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，且在體內(nèi)能夠部分替代肝細(xì)胞的功能［1，4，11］。

表2 血清學(xué)檢測指標(biāo)比較±s，n=12)

表2 血清學(xué)檢測指標(biāo)比較±s，n=12)

與模型組比較，*P＜0.05;與MSC組比較，#P＜0.05;與G－CSF組比較，△P＜0.05

指標(biāo) 時間(h) 對照組 SAP模型組 MSC組 G－CSF組 MSC+G－CSF組12 113.3±18.4* 277.9±53.2 275.5±50.2 271.4±54.3 271.0±51.8 ALT(U/L) AST(U/L) Bun(mmol/L) Cr(μmol/L) LDH(U/L) TNF－α (ng/L) IL－6(ng/L) CRP(mg/L) 24 115.4±20.1* 355.4±61.8 312.1±59.4 310.7±60.1 305.5±55.2* 48 110.9±17.9* 354.8±58.7 304.8±54.7* 305.7±55.1* 262.6±43.1*#△72 112.8±17.2* 349.1±56.6 265.3±45.9* 275.5±54.4* 228.8±50.7*#△12 202.7±24.2* 734.0±94.5 712.4±87.9 723.5±91.2 708.6±95.1 24 210.4±31.2* 1325.4±187.1 1210.5±167.1 1240.3±163.8 1165.9±159.8* 48 204.3±26.7* 1387.1±190.3 1003.8±155.9* 1136.4±160.2* 876.6±144.2*#△72 206.7±27.3* 1298.2±184.5 899.3±146.2* 1004.2±153.0* 747.3±142.6*#△12 3.95±0.54* 17.9±6.2 12.9±4.2* 13.4±4.3 10.0±3.8* 24 4.04±0.65* 22.4±7.8 14.1±6.4* 16.0±7.1* 12.8±4.2* 48 4.12±0.59* 34.8±9.7 25.8±8.7* 23.9±8.6* 16.6±7.3*#△72 4.08±0.52* 40.1±10.6 32.3±9.9* 29.5±9.4* 22.1±7.7*#△12 38.7±4.2* 90.5±20.3 65.4±17.9* 63.5±16.2* 58.6±15.1* 24 37.4±5.2* 115.2±24.1 69.5±17.1* 72.3±17.8* 62.9±15.8* 48 42.1±5.7* 137.0±26.3 83.8±18.9* 88.4±19.2* 67.5±17.2*#△72 40.0±5.3* 148.2±28.5 92.3±19.4* 91.2±20.0* 74.0±18.6*#△12 160.0±21.6* 1305.6±187.5 1184.6±160.3 1204.3±166.2 1108.4±162.3* 24 157.3±24.1* 2453.5±344.2 2025.1±262.6* 2106.9±285.4* 1665.0±208.4*#△48 165.1±25.5* 2299.0±308.4 1689.4±210.4 1711.5±225.1* 1251.7±181.0*#△72 159.2±20.8* 1973.1±251.7 1338.2±195.3* 1345.2±203.8* 884.9±148.6*#△12 45.1±3.8* 205.4±32.8 205.0±40.1 204.4±38.7 202.8±41.2 24 48.0±6.0* 231.3±33.1 210.3±30.6 211.2±32.3 202.5±31.7* 48 43.5±4.1* 247.2±38.3 215.6±32.1* 216.8±31.3* 190.3±29.2＊△72 51.3±6.7* 237.1±35.5 204.2±31.0* 207.0±30.4* 178.7±28.9*#△12 158.7±20.8* 1224.1±180.6 1105.9±159.0 1101.4±172.1 1080.2±150.0* 24 153.5±25.4* 1408.3±251.1 1224.1±170.6* 1222.1±175.4* 1215.3±172.1* 48 160.1±21.5* 1374.5±198.7 1170.3±160.2* 1198.9±164.3* 1032.1±150.6*#△72 155.4±20.3* 1289.2±179.4 995.6±143.7* 1052.0±155.2* 861.4±140.9*#△12 0.95±0.24* 4.70±2.52 2.93±1.82 3.03±2.05 1.76±0.65* 24 1.01±0.31* 4.85±2.81 3.09±1.91 3.13±2.11 1.85±0.73* 48 1.10±0.22* 5.43±2.74 3.21±2.28* 3.29±2.02* 1.90±0.71＊△72 1.06±0.27* 5.18±2.69 3.16±1.95* 3.20±2.06* 1.71±0.58*#△

本研究結(jié)果顯示MSC+G－CSF組大鼠72h死亡率較模型組和G－CSF組低，肝臟和腎臟病理損害最輕，表明MSC可能通過減輕肝臟等、腎臟多器官損害降低SAP病死率。同時我們發(fā)現(xiàn)48h/72h血清炎癥指標(biāo)TNF－α、IL－6和CRP含量，肝、腎功能指標(biāo)ALT、AST、BUN、Cr、LDH明顯下降，肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)也明顯下降，且下降程度較單獨治療組明顯，證明MSC在抑制SAP早期炎癥級聯(lián)反應(yīng)及細(xì)胞凋亡中確有作用，并能有效減輕胰腺炎時肝腎功能的損害，但MSC組與G－CSF組各指標(biāo)比較無明顯差別。筆者認(rèn)為MSC移植與MSC動員技術(shù)途徑不同，但作用相似，聯(lián)合治療組的實驗結(jié)果優(yōu)于單獨治療組，可能與MSC量的疊加或HSC的促協(xié)同及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

通過本項研究，我們看到了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對SAP肝臟和腎臟功能損害有明確的保護作用，其中MSC確實發(fā)揮抗炎癥及抗細(xì)胞凋亡等作用，并且聯(lián)合治療效果優(yōu)于單獨治療。

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