用HPLC法測定人血漿中美羅培南的濃度

陳曉晶，梁海濤，覃韋葦，李中東＊，徐一新

（1.上海健康職業(yè)技術學院藥學教研室，上海200237；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院藥劑科，上海200040）

美羅培南是一種具有廣譜抗菌活性的碳青霉烯類抗生素，通過抑制細菌細胞壁的合成而產生抗菌作用。該藥常用于治療致病菌不明的感染，或者由單一或多種細菌引起的成人及兒童的各類重癥感染，例如復雜性腹腔感染、醫(yī)院獲得性肺炎、嚴重的社區(qū)獲得性肺炎、伴囊性纖維化癥的肺部感染、細菌性腦膜炎、敗血癥等［1］。雖然美羅培南中樞神經系統(tǒng)（CNS）安全性好，神經毒性低于亞胺培南／西司他汀鈉，但是腎功能受損的病人使用美羅培南，仍可能出現嚴重的CNS不良反應。因此對于腎功能受損的病人，應該根據不同病人的藥動學特征減少美羅培南的劑量或延長給藥間隔［2］。

本研究旨在建立測定人血漿中美羅培南的HPLC－UV法，為其藥動學研究和臨床血藥濃度監(jiān)測提供參考，促進臨床合理、安全使用美羅培南。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器、Waters 2487型雙波長紫外檢測器、Millennium 32色譜數據工作站（美國Waters公司）；Sigma 3k－15型高速離心機（德國Sigma公司）；Millivac小型真空泵（美國Millipore公司）；Bond Elut固相萃取小柱（C 2，100mg，1ml，美國Varian公司）；VacMaster－20型半自動真空固相萃取裝置（美國VacMaster公司）；BP－211D十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品和試劑 美羅培南標準品（純度87%，批號130506－200702）；氫氯噻嗪對照品（純度＞98%，批號100309－200702，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇（色譜純，美國Promptar公司）；磷酸二氫鉀（分析純，汕頭金砂化工廠有限公司）；甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；三乙胺（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；純化水由Milli－Q超純水器（美國Millipore公司）制備?？瞻籽獫{由復旦大學附屬華山醫(yī)院血庫提供。

2 方法和結果

2.1 溶液的配制 精密稱取美羅培南標準品適量，用水溶解并配制成濃度為1.00mg／ml的儲備液；用甲醇∶水（50∶50）稀釋此儲備液，配制成濃度為750、250、100、25、10、5μg／ml的美羅培南系列標準品溶液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取內標氫氯噻嗪對照品適量，置10ml容量瓶中，用水溶解并配制成濃度為1.00mg／ml的儲備液；用甲醇∶水（50∶50）稀釋此儲備液，配制成濃度為500μg／ml的氫氯噻嗪內標工作溶液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血漿樣品預處理 Bond Elut固相萃取柱預先用1ml甲醇和1ml純化水依次處理。取200μl血漿樣品，加入50μl的氫氯噻嗪內標溶液，渦旋混勻后過固相萃取柱，用0.5ml濃度為5mmol／L的磷酸二氫鉀溶液（pH 6）洗滌，真空抽濾至固相萃取柱床干燥，棄去濾液。然后用0.5ml甲醇－0.1%甲酸（15∶85）洗脫。洗脫液經1.15×104×g離心5min，取上清液進樣分析。

2.3 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流動相：5mmol／L磷酸二氫鉀溶液（pH 6）－甲醇（15∶85）；柱溫：40℃；流速：1ml／min；檢測波長：298nm；進樣量：40μl；內標物：氫氯噻嗪。

2.4 方法專屬性 分別取6份不同來源的空白血漿200μl，制備不含美羅培南和氫氯噻嗪的空白血漿陰性對照，按2.2項下方法操作，即得。與含有美羅培南、氫氯噻嗪的血漿樣品比較，由圖1可見，美羅培南、氫氯噻嗪保留時間分別為7.2和6.1min，兩者分離良好，血中內源性物質不干擾樣品測定。

圖1 人血漿中美羅培南和內標的HPLC譜圖

2.5 標準曲線與定量下限 取空白血漿200μl，精密量取美羅培南系列標準品溶液適量，分別配制美羅培南濃度為75、25、10、2.5、1.0、0.5μg／ml的血漿樣品，按2.2項下方法處理，每一濃度進行雙樣本分析。以待測物色譜峰面積與內標色譜峰面積比（Y）為縱坐標，待測物濃度（X）為橫坐標，用加權（W＝1／x2）最小二乘法進行回歸計算，回歸方程為Y＝0.123 1 X＋0.046 01，r＝0.998 0。美羅培南在0.5～75μg／ml內的線性關系良好。定量下限可達0.5μg／ml。

2.6 精密度實驗 取空白血漿200μl，精密量取美羅培南系列標準品溶液適量，分別配制美羅培南濃度為40、10、1.5μg／ml 3種不同濃度的血漿樣品，按2.2項下方法處理后進行色譜分析，在一個分析批內測定6次，計算批內精密度。在不同日連續(xù)制備并測定3個分析批次，計算批間精密度。計算得到批間精密度RSD＜12.7%（n＝3），批內精密度RSD＜11.4%（n＝6）。

2.7 回收率實驗 取空白血漿200μl，按2.1項下方法分別制備低、中、高濃度（美羅培南濃度分別為1.5、10、40μg／ml）血漿樣品，按2.2項下方法處理后進樣分析，每一濃度進行6樣本分析。同時用流動相配制相同濃度的美羅培南和氫氯噻嗪內標混合溶液。分別進樣分析，以每一濃度兩種處理方法的峰面積的比值計算回收率。結果表明，低、中、高濃度美羅培南的回收率分別為（90.5±8.7）%、（86.8±8.4）%和（91.7±7.9）%（n＝6）。

2.8 穩(wěn)定性考察 測定血漿樣品在室溫放置2h、－70℃冰箱放置10d、－20℃冰箱反復凍融3次，以及樣品處理后在自動進樣器內4℃放置12h的穩(wěn)定性，每一種濃度平行操作3次。結果見表1。由表1可見，樣品在考察的放置條件下穩(wěn)定。

表1 血漿中美羅培南在不同條件下的穩(wěn)定性實驗結果（n＝3，ρB／μg·ml－1）

3 討 論

文獻報道測定人血中美羅培南的方法，分別采用了沉淀蛋白質、超濾后直接進樣等樣品前處理方法［3－5］。沉淀蛋白質法以乙腈沉淀蛋白質后采用二氯甲烷清洗上清液，步驟繁瑣，并且二氯甲烷毒性較大，對人體和環(huán)境有一定的危害。超濾后直接進樣的方法需要特殊的儀器設備。本研究參考文獻報道的固相萃取法處理樣品［6］，并做了改進，選擇了適當的內標，減少了血漿樣品體積，保證了固相萃取處理過程和測定過程的可控性和準確性，減少了病人采血的痛苦。

據文獻報道，健康志愿者單次靜脈滴注美羅培南0.5g后，血漿峰濃度為（21.1±10.7）μg／ml［7］。連續(xù)性腎臟替代治療病人靜脈滴注美羅培南1.0g后，血漿峰濃度為（48.5±12.3）μg／ml［5］。燒傷病人靜脈滴注美羅培南0.5g后，血漿峰濃度為（36.4±10.5）μg／ml［8］。本方法可以在0.5～75μg／ml的線性范圍內準確、快速測定血漿中的美羅培南，能夠滿足美羅培南人體藥動學研究的需要。

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