正交試驗(yàn)優(yōu)選腎炎消白顆粒提取工藝及中試研究

白海玉，韓德強(qiáng)，楊微，王朝宇

腎炎消白顆粒是我院長(zhǎng)期使用的一種醫(yī)院制劑，是由黃芪、枸杞子等12味常用中藥組成的純中藥制劑，具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、利水滲濕的功能，用于慢性腎小球腎炎、腎病綜合征。為了適應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)的需要，現(xiàn)對(duì)十年前腎炎消白顆粒工藝進(jìn)行深一步的研究，因?yàn)楸咎幏街悬S芪為君藥，黃芪甲苷為其主要活性成分之一，因此本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室研究和中試研究階段擬以黃芪甲苷的含量及總浸膏得率為指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，以優(yōu)選其提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器

P680HPLC高效液相色譜(美國(guó)戴安公司);ALL-tech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;北京中惠普分析技術(shù)研究所SPB-3全自動(dòng)空氣源;ZF型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)，BT205S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);TO200.0型提取罐(常熟市中藥制藥機(jī)械總廠);黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：10781-200512)。

1.2 材料

甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)迪克馬公司);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;黃芪甲苷(批號(hào)：10781-200912)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;黃芪、枸杞子、益母草等均購(gòu)于哈爾濱世一堂中藥材飲片廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)相關(guān)資料和有關(guān)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交表，對(duì)影響提取工藝的主要因素加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。以干膏重量和黃芪甲苷含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。腎炎消白顆粒實(shí)驗(yàn)室提取工藝因素與水平的關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

1.3.2 腎炎消白顆粒黃芪甲苷的含量測(cè)定［1-2］

1.3.2.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，預(yù)柱(phenomenex，security Guard Cartridges C18 4 mm×30 mm);流動(dòng)相：乙腈-水(32 ∶68);流速：1.0 ml/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液10 μl、20 μl，供試品溶液20 μl;漂移管溫度105℃，氣體流速3.0 L/min。

1.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含黃芪甲苷0.12 mg的溶液，即得。

1.3.2.3 供試品溶液的制備 將每份按處方比例混合的藥材粗粉約132 g，依照正交設(shè)計(jì)工藝流程提取，濃縮，放入真空箱干燥，制成提取物干燥粉末。取本品，研細(xì)，精密稱取10.021 2 g，加甲醇100 ml，加熱回流至提取液無(wú)色，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 ml，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20 ml，棄去氨試液，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2.4 陰性對(duì)照樣品溶液的制備 取無(wú)黃芪腎炎消白處方，按工藝制備無(wú)黃芪的陰性樣品，并按“1.3.2.3”方法制備，即得。

1.3.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液10 μl、20 μl，供試品溶液及陰性樣品溶液各 10 μl注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按上述色譜條件計(jì)算色譜圖，按黃芪甲苷峰計(jì)算，理論塔板數(shù)為4 000以上。在該色譜條件下黃芪甲苷峰的保留時(shí)間為13 min左右，陰性對(duì)照樣品溶液在與黃芪甲苷相同的保留時(shí)間處未見(jiàn)峰出現(xiàn)，故認(rèn)為無(wú)干擾，黃芪甲苷峰與鄰近峰達(dá)到基線分離，分離度良好。

1.3.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.008 5，0.017 0，0.034 0，0.068 0，0.136 0 mg/ml，分別進(jìn)樣 10 μl，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，峰面積的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(y)，回歸方程為y=1.135 1 x+4.220 7，r=0.999 8;黃芪甲苷在 0.085 ～1.256 μg范圍線性關(guān)系良好。

1.3.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果所得黃芪甲苷峰面積的 RSD為1.02%，精密度良好。

1.3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別在0，2，4，8，12 h測(cè)定，結(jié)果所得黃芪甲苷峰面積的RSD為1.05%，表明黃芪甲苷在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.3.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取腎炎消白顆粒共6 份，按“1.3.2.3”方法制成供試品溶液。結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為 0.85 mg/1 000 g，RSD為1.60%，重復(fù)性良好。

1.3.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，每份5 g，精密稱定。分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品0.153 mg/ml，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，經(jīng)計(jì)算加樣回收率為98.93%，RSD為1.13%，表明本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可行。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of the recovery experiment

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)法，以出膏率和黃芪甲苷含量作為綜合指標(biāo)進(jìn)行方差分析和直觀分析。正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析見(jiàn)表3～5。結(jié)果表明，選擇A3B2C3，即加8倍量水煎煮3次，每次2 h為最佳提取條件。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab 3 Results of orthogonal test analysis

表4 浸膏率方差分析(α=0.05)Tab 4 Variance analysis on extract

表5 黃芪甲苷含量方差分析(α=0.05)Tab 5 Variance analysis on Astragaloside IV content

2.2 中試試驗(yàn)結(jié)果

中試選擇實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：加8倍量水煎煮3次，每次2 h。本實(shí)驗(yàn)每次投料15.84 kg，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上采用每隔30 min在提取罐的上、中、下不同部位取樣，以干膏重量和黃芪甲苷含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。由于中試量較大，此項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)2次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。通過(guò)中試數(shù)據(jù)綜合考察出膏率和黃芪甲苷含量因素，確定最佳工藝為加8倍量水煎煮3次，一煎、二煎各1.5 h，三煎1 h為最佳提取條件。

3 討論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)腎炎消白顆粒的水提工藝進(jìn)行了優(yōu)選，并進(jìn)行了中試放大，發(fā)現(xiàn)二者之間存在一定的差異，中試放大是在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)的工藝路線確定后，采用該工藝在模擬工業(yè)化生產(chǎn)的條件下所進(jìn)行的工藝研究，以驗(yàn)證放大生產(chǎn)后原工藝的可行性，保證研發(fā)和生產(chǎn)時(shí)工藝的一致性。中試放大是藥品研發(fā)到生產(chǎn)的必由之路，也是降低產(chǎn)業(yè)化實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)的有效措施，是聯(lián)結(jié)實(shí)驗(yàn)室工藝和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的橋梁，可為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)積累必要的經(jīng)驗(yàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有重要意義。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室工藝和中試工藝的比較證明由于熱量傳導(dǎo)、攪拌與傳質(zhì)等試驗(yàn)條件的改變會(huì)導(dǎo)致兩者之間存在差異，在以后的實(shí)踐工作中將進(jìn)一步客觀、深入地分析和 闡述二者之間產(chǎn)生差異的原因。

表6 中試試驗(yàn)結(jié)果Tab 6 Factors and results of medium enlarge test

［1］中國(guó)藥典.一部［S］.2010：283.

［2］丘明明.HPLC-ELSD測(cè)定止血靈膠囊中黃芪甲苷的含量［J］.中成藥，2008，30(8)：附6-7.