黃芩苷對高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞增殖的影響

林銳珊 蘇寧 趙平 吳紹鋒

黃芩苷對高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞增殖的影響

林銳珊 蘇寧 趙平 吳紹鋒

目的 探討不同劑量的黃芩苷對高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞（GMC）增殖的影響，以期探索黃芩苷防治DN的藥效機制，為中醫(yī)藥防治DN提供新的視角和實驗根據(jù)。方法 體外培養(yǎng)大鼠腎小球系統(tǒng)細胞（GMC）并分為9組：正常組（LG 5.5mmol/L）、模型組（HG 25mmol/L）、黃芩苷1組（HG 25mmol/L+黃芩苷3.125μmol/L）、黃芩苷2組（HG 25mmol/L+黃芩苷6.25μmol/L）、黃芩苷3組（黃芩苷（HG 25mmol/L+黃芩苷12.5μmol/L）、黃芩苷4組（HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L）、黃芩苷5組（HG 25mmol/L+黃芩苷50μmol/L）、黃芩苷6組（HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L）和PKC抑制劑組（HG 25mmol/L+ PKC抑制0.5 nmol/L），每組設平行6孔，培養(yǎng)24h、48h、72h后，應用MTT比色法檢測各組GMC增殖情況，倒置顯微鏡下觀察各組GMC生長情況，評價黃芩苷對GMC生長的影響。結(jié)果 從各時間點測得的OD值可見，用藥組與高糖組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），黃芩苷組與PKC陽性藥組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。從抑制率可見，24h時，除了黃芩苷6組（即給藥劑量為100μmol/L）對高糖刺激后GMC增殖有抑制作用之外，其余各組對高糖刺激后GMC增殖均無抑制。48h、72h隨著時間增加，各組對高糖刺激后GMC增殖的抑制率逐漸升高，且隨著黃芩苷濃度增加抑制率逐漸增高。結(jié)論 高糖環(huán)境下，體外培養(yǎng)GMC存在異常增殖現(xiàn)象，黃芩苷對高糖刺激GMC增殖有抑制作用，且具有一定劑量效應關系。即抑制率隨著黃芩苷濃度的增高而升高，尤其是25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三組的時間劑量依賴關系更加明顯，且在72h的時間點抑制率最高，抑制效果最佳。

腎小球系膜細胞；黃芩苷；高糖環(huán)境；增殖

黃芩苷（Baicalin Bai）是從清熱解毒中藥黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）中提取的一種黃酮類化合物，具有抗菌、消炎和抗氧化等藥理作用[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有防治DN的作用[3-4]。為進一步探討黃芩苷防治DN的機制，我院實驗室課題組研究了黃芩苷不同藥物濃度對高糖環(huán)境下的腎小球系膜細胞增殖的抑制情況，以期探索黃芩苷防治DN的藥效機制，為中醫(yī)藥防治DN提供新的視角和實驗根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠腎小球系膜細胞株(HBZY-1)；購于湖北省博士德生物有限公司。

1.2 實驗藥物及試劑 黃芩苷(純度為98%）：購于南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司；PKC抑制劑，購于碧云天生物有限公司，高、低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶溶液、噻唑藍、二甲基亞楓均購于美國GIBGO公司。

1.3 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，高速臺式離心機，超純水系統(tǒng)，全波長酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 實驗共分為9組，分別為：正常組（LG5.5mmol/L）、模型組（HG 25mmol/L）、黃芩苷1組（HG 25mmol/L+黃芩苷3.125μmol/L）、黃芩苷2組（HG 25mmol/L+黃芩苷6.25μmol/L）、黃芩苷3組（黃芩苷（HG 25mmol/L+黃芩苷12.5μmol/L）、黃芩苷4組（HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L）、黃芩苷5組（HG 25mmol/L+黃芩苷50μmol/L）、黃芩苷6組（HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L）和PKC抑制劑組（HG 25mmol/L+ PKC抑制0.5nmol/L），每組6孔。

1.4.2 MTT法檢測黃芩苷對細胞增殖的影響方法：選取經(jīng)培養(yǎng)3～5代的腎小球系膜細胞培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，待細胞生長至80%融合時，用0.25%胰酶溶液消化，制成細胞混懸液，并用細胞計數(shù)板計數(shù)，把細胞混懸液調(diào)至2×104/mL的細胞濃度。然后，往96孔板加入細胞混懸液，每孔加入100μL，共鋪3板，四圍用PBS封閉，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，同步化后，按照原設計分組，加入200μL/孔的相應濃度的溶液，空白組加DMEM/F12（含10%FCS），模型組加入25mmol/L的DMEM/F12，其余各組均加入用25mmol/L的DMEM/F12配制的相應濃度的藥物溶液，原條件繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h、48h、72h后，加入MTT20μL/孔，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4h后，吸去MTT液，加入DMSO 150μL/孔，振蕩10min，用酶標儀觀察，在492nm波長處記錄吸光度OD值，空白孔調(diào)零。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，實驗所得數(shù)值均以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間使用單方向方差χ2分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點高糖對GMC增殖作用的影響 高糖組在24h、48h、72h的吸光值均較低糖組增高（P＜0.05），且隨培養(yǎng)時間延長而增高明顯。根據(jù)OD值計算出各個時間點平均增殖率，可見高糖刺激后GMC在24h、48h、72h的增殖率呈逐漸增大趨勢。實驗結(jié)果顯示，25mmol/L的高糖對GMC增殖有促進作用，且呈時間依賴性，見表1。的增殖后就會出現(xiàn)接觸抑制，而容易出現(xiàn)如Andrea C、魏吉林等研究證實的高糖狀態(tài)下，GMC增殖先促進后抑制的現(xiàn)象[8-9]。本實驗根據(jù)實驗要求，在進行MTT檢測GMC增殖狀況之前，選用了三種不同的接種濃度，根據(jù)測出的生長曲線，認為GMC最佳接種濃度為2×104/mL，因此排除了因細胞濃度過高產(chǎn)生自我接觸抑制的可能。

表1 不同濃度葡萄糖環(huán)境下GMC不同時間點OD值（±s）

表1 不同濃度葡萄糖環(huán)境下GMC不同時間點OD值（±s）

注：與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01。

組別 例數(shù) 不同時間點OD值24h 48h 72h正常組 6 0. 339±0.021 0.544±0.024 0.908±0.025模型組 6 0.352±0.031a 0.586±0.072a 1.017±0.046b

目前，體外實驗研究關于黃芩苷對細胞的抑制作用，很少涉及到其對GMC增殖的影響。本實驗采用濃度梯度劑量作用于GMC，最小劑量為3.325μmol/L、最大劑量100μmol/L。從實驗結(jié)果可見，黃芩苷對體外培養(yǎng)的GMC增殖具有一定抑制作用，且呈時間、劑量依賴性。黃芩苷和PKC抑制劑在24h以前未發(fā)生抑制，此時間段，以高糖刺激作用為主。24h后，黃芩苷和PKC抑制劑均對高糖刺激GMC增殖有抑制作用，且具有一定劑量效應關系。即抑制率隨著黃芩苷濃度的增高而升高，尤其是25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三組的時間劑量依賴關系更加明顯、穩(wěn)

表2 不同組不同時間點OD值和抑制率（±s；n=6）

表2 不同組不同時間點OD值和抑制率（±s；n=6）

注：與模型組比較，aP<0.05，b與PKC陽性藥組比較P<0.05；λ=492。

不同時間點的抑制率(%)24h 48h 72h 24h 48h 72h模型組 - 0.352±0.031 0.586±0.072 1.017±0.046a — — —黃苓苷1組 3.125μmol/L 0.331±0.024 0.547±0.040 0.935±0.127b -6.01 6.49 8.03黃苓苷2組 6.25μmol/L 0.377±0.016 0.598±0.028 0.948±0.073ab -7 -2.19 7黃苓苷3組 12.5μmol/L 0.392±0.039 0.609±0.048 0.932±0.064ab -11.26 -4.09 8.29黃苓苷4組 25μmol/L 0.399±0.038a 0.570±0.036ab 0.790±0.062ab -13.35 2.56 22.23黃苓苷5組 50μmol/L 0.389±0.022a 0.563±0.053ab 0.656±0.022ab -10.41 3.81 35.47黃苓苷6組 100μmol/L 0.377±0.039a 0.498±0.049ab 0.592±0.022ab 7.10 14.99 41.71 PKC陽性藥組 0.5nmol/L 0.289±0.028 0.340±0.034b 0.407±0.023b -17.76 41.93 59.96組別 藥物劑量 不同時間點OD值

2.2 黃芩苷對高糖環(huán)境下GMC增殖的抑制作用的比較從表2各時間點測得的OD值可見，用藥組與高糖組比較均有差異，但黃芩苷3.25μmol/L、6.25μmol/L差異不顯著，其它各組差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），黃芩苷組與PKC陽性藥組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

從抑制率可見，24h時，除了黃芩苷6組（即給藥劑量為100μmol/L）對高糖刺激后GMC增殖有抑制作用之外，其余各組對高糖刺激后GMC增殖均無抑制。48h、72h隨著時間增加，各組對高糖刺激后GMC增殖的抑制率逐漸升高，且隨著黃芩苷濃度增加抑制率逐漸增高。

3 討論

糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是指糖尿?。―iabetes mellitus，DM）時發(fā)生的腎小球、腎小管、腎間質(zhì)和腎血管病變[5]。GMC是一種腎小球固有細胞，屬于間質(zhì)細胞，在腎臟細胞和生理功能方面發(fā)揮重要作用。DN早期可見GMC肥大，數(shù)量增多，并由此導致腎小球高濾過狀態(tài)、ECM積聚和基底膜增厚，繼而產(chǎn)生一系列反應，最終導致腎小球毀損、硬化?？梢?，GMC的病理變化在DN的發(fā)生和發(fā)展中居于中心地位[6]。有研究證實，減少ECM的積聚，拮抗細胞因子的不良作用，抑制GMC的增殖活化是防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進展的重要環(huán)節(jié)[7]

高糖是DN發(fā)生發(fā)展的始動因素，高糖對GMC增殖作用的影響，由于不同研究使用的方法不同，且在用MTT進行檢測時，接種細胞的濃度不同，結(jié)果也有差異。接種密度過大，細胞經(jīng)過短暫定，且在72h的時間點抑制率最高，抑制效果最佳。

[1] 康杰芳，任婷婷.中藥黃芩的研究進展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學,2009，55（4）：128-133.

[2] 藍遠強,石桂英.黃芩苷片治療慢性肝病36例臨床觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2008,6(6):184-186.

[3] 蘇寧，周樂全，匡忠生，等.黃芩苷下調(diào)TGF-β1、PKC表達減少腎小管IV-C沉積的作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2008，19(4)：272-274.

[4] 蘇寧，李豐，趙平，等.黃芩苷調(diào)節(jié)DN大鼠腎臟局部生物活性物質(zhì)的實驗研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5(1):22-24.

[5] 陳明，李珺.糖尿病腎病的發(fā)燕尾服機制研究進展[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4（5）：234.

[6] Gomez-GuerreroC,Heng,WEN Kai-hui,et al.The XTT colorimetric assay measuring the cell groeth curve[J].Med J Nat Def Force North China,2007,19(4):7.

[7] Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics[J].Kidney Int,2006,69(2):213-217.

[8] Andrea C S,Bruce MH.The regulation of mesangial cell proliferation[J].Nephron Exp Nephrol,2008,108(4):74-79.

[9] 魏吉林，李偉，李雪俠.靈芝對高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞增殖及細胞周期的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008，9（1）：61-62.

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.100

廣州中醫(yī)藥大學校級創(chuàng)新基金資助項目 （10CX073）

510006 廣州中醫(yī)藥大學西醫(yī)基礎公共實驗室 （林銳珊 蘇寧吳紹鋒） 510000 廣州益善生物技術有限公司 （趙平）

蘇寧 E-mail：sunning@gzhtcm.edu.cn