發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯檢測(cè)的研究進(jìn)展

劉功良，陶嫦立，白衛(wèi)東 *，趙文紅，王姣姣

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）可由氫氰酸、尿素、瓜氨酸、N-氨甲?；鶑?fù)合物（氨甲酰磷酸鹽）等前體物質(zhì)與乙醇反應(yīng)得來，此反應(yīng)可在食品在發(fā)酵和貯藏的過程中自發(fā)進(jìn)行[1-2]。EC在腐乳、面包、酸奶、奶酪、醬油、醋和酒精飲料等發(fā)酵食品中都被檢出[3-4]，其質(zhì)量濃度變化范圍為ng/L（或ng/kg）至mg/L[5-6]。

EC對(duì)人體具有潛在的致癌性，可從腸道和皮膚被快速吸收，吸收程度接近100%[7]。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署已將氨基甲酸乙酯劃列為2A類的致癌物[8-9]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)規(guī)定EC的基準(zhǔn)劑量可信限的下限值為每天0.3mg/kg從面包、發(fā)酵乳制品和醬油中EC的平均攝入量每天不超過15ng/kg；包括酒精飲料在內(nèi)，EC的平均攝入量每天不超過80ng/kg[6]。

由于氨基甲酸乙酯的危害作用及其在發(fā)酵食品中廣泛存在，檢測(cè)發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量對(duì)食品安全以及人體健康具有重要意義。文章對(duì)發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯檢測(cè)的預(yù)處理，檢測(cè)方法的種類及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 樣品預(yù)處理方法

發(fā)酵食品中營(yíng)養(yǎng)豐富，基質(zhì)種類眾多，很容易對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾，因此，在采用儀器分析方法檢測(cè)EC的含量之前，通常需要對(duì)發(fā)酵食品進(jìn)行預(yù)處理，將其所含的EC提取出來，盡可能分離純化。常用的預(yù)處理方法主要有液/液萃取、固相萃取、固相微萃取和頂空固相微萃取等。

1.1 液/液萃取

現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，如進(jìn)出口商品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)“出口酒類中氨基甲酸乙酯殘留量檢驗(yàn)方法”（SN0285-1993）中采用的即為溶劑萃取法（LLE），該預(yù)處理方法過程比較復(fù)雜，操作繁瑣，所需時(shí)間也較長(zhǎng)，無法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，且色素等雜質(zhì)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能滿足目前的快速準(zhǔn)確分析檢測(cè)需要[4，10]。

1.2 固相萃取

國(guó)際葡萄與葡萄酒組織（OIV）、美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）和歐盟（EU）推薦的飲料酒中EC的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，均采用固相萃?。⊿PE）作為預(yù)處理方法。與液液萃取相比，SPE方法具有速度較快、成本低、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，但操作較煩瑣，樣品預(yù)處理需1h左右，在產(chǎn)品規(guī)?；瘷z測(cè)時(shí)速度較慢，且需用使用一定危害的有機(jī)溶劑，不利于分析人員的身體健康[11-12]。

1.3 頂空固相微萃取

頂空固相微萃?。℉S-SPME）是最近被采用的預(yù)處理方法之一，該方法不需要人工預(yù)濃縮，樣品預(yù)處理能在5min內(nèi)完成，自動(dòng)便捷、快速高效，適合規(guī)?；瘻y(cè)定，且無需有機(jī)溶劑，安全環(huán)保。SPME和氣相色譜聯(lián)用，再與高靈敏度的檢測(cè)器如質(zhì)譜、電子捕獲檢測(cè)器、原子發(fā)射光譜檢測(cè)器結(jié)合，可使檢出限達(dá)到μg/L～ng/L的級(jí)別。多次頂空固相微萃?。∕HS-SPME）能夠克服通常存在于SPME分析中的基質(zhì)干擾效應(yīng)，尤其適合于大量不同基質(zhì)的樣品分析[13-14]。

2 氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法

發(fā)酵食品經(jīng)過預(yù)處理后，通常采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)氨基甲酸乙酯的含量，除此之外，還有高效液相色譜法、傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)法、核磁共振分光檢定法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等。

2.1 氣相色譜法

王立媛等[15]建立了一種同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法用于腐乳中氨基甲酸乙酯含量，該方法的加標(biāo)回收率在89%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10%，最低檢測(cè)限達(dá)到2.0μg/kg，可作為腐乳中氨基甲酸乙酯含量檢測(cè)的確證方法。HORIIS等[16]結(jié)合頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，建立并優(yōu)化了一種方法用以檢測(cè)酒精飲料中EC的含量，檢測(cè)限為6.7μg/L，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～2.0%，回收率為103.6%～107.6%。何碧英等[17]將結(jié)合固相分散萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，建立了一種檢測(cè)氨基甲酸乙酯的方法，并定量檢測(cè)了葡萄酒、蘋果醋、酸奶、醬油等發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯的含量，為發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的危險(xiǎn)性評(píng)估提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。張燕等[18]建立了一種固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC/MS）方法，用以檢測(cè)醬油中氨基甲酸乙酯的含量，方法的檢出限（S/N=3）為1.0μg/L，醬油中氨基甲酸乙酯的回收率為70.56%～129.21%，檢測(cè)結(jié)果的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.69%，日間RSD為8.50%。張雪娜等[13]建立了多次頂空固相微萃取-氣相色譜法（MHS-SPME-GC）用以檢測(cè)多種酒精飲料中EC的含量。該方法的檢測(cè)線性范圍為0.04mg/L～100mg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.9997，檢出限為34μg/L；重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19%；準(zhǔn)確度高，加標(biāo)回收率在90.9%～103.6%。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是檢測(cè)發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的常用方法，預(yù)處理簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，檢測(cè)技術(shù)較為成熟，應(yīng)用范圍廣，可作為標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行推廣。

2.2 高效液相色譜法

PARK SK等[19]使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，建立了一種檢測(cè)韓國(guó)醬油產(chǎn)品中EC含量的方法，當(dāng)EC的質(zhì)量濃度在10μg/L～100μg/L和0.1μg/L～20μg/L范圍內(nèi)變化時(shí)，該方法具有良好的線性關(guān)系，加標(biāo)的平均回收率為（92.2±1.7）%。MADRERA RR等[20]利用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器（HPLC-FLD），建立了一種檢測(cè)蘋果類酒精飲料中EC含量的方法，檢測(cè)曲線的線性相關(guān)系數(shù)超過0.9999，檢測(cè)限與定量限值分別為1.64μg/L和3.56μg/L，回收率為94%～98%，檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)不超過5%[20]。YE CW[14]結(jié)合多重頂空固相微萃取與氣相色譜/氮磷檢測(cè)器，建立并優(yōu)化了一種檢測(cè)不同酒精飲料中EC含量的方法，檢測(cè)限為0.034mg/L，線性范圍為0.04mg/L～100mg/L，檢測(cè)結(jié)果的RSD為2.19%，線性相關(guān)系數(shù)為0.9997。FU M L等[21]使用HPLC-FLD建立了一種檢測(cè)中國(guó)黃酒中EC含量的方法，檢測(cè)結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)為0.9990，該方法的檢測(cè)限和定量限為73.2μg/L和243.9μg/L，加標(biāo)回收率為98.30%～101.30%，檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度（RSD）不超過5%。諸葛慶等[22]建立一種反相高效液相色譜法測(cè)定黃酒中氨基甲酸乙酯的方法。EC的質(zhì)量濃度在50.0μg/L～250.0μg/L范圍內(nèi)，該方法的平均回收率為92.9%，RSD為4.5%（n=6），檢出限為10μg/L，線性范圍為100μg/L～1500μg/L（R=0.9995），測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜-質(zhì)譜法基本相同。

高效液相色譜在檢測(cè)EC之前，需要柱前衍生，成本較高，且不如GC-MS法靈敏，因此其應(yīng)用范圍不如GC-MS廣。

2.3 傅里葉紅外光譜法

LACHENMEIERD W[23]利用偏最小二乘法結(jié)合傅里葉變換近紅外光譜，建立了一種快速檢測(cè)核果類酒精飲料中EC含量的方法。除了能檢測(cè)樣品中EC的含量之外，傅里葉變換紅外光譜法還能顯示EC的前體物質(zhì)氫氰酸和貯藏過程中EC含量的最大值等相關(guān)信息，但在定量檢測(cè)方面，該方法的準(zhǔn)確度和精確度很低，只能用于篩分分析過程中的半定量檢測(cè)。通過使用該方法，60%～70%的樣品可以被鑒定為陰性樣品，剩余的樣品可使用操作復(fù)雜、勞動(dòng)強(qiáng)度高的參照分析方法定量檢測(cè)EC的含量。

隨著研究的深入，傅里葉紅外光譜（FTIR）方法的靈敏度和精密度的進(jìn)一步提高，F(xiàn)TIR方法必將是EC檢測(cè)快速、方便的一種檢測(cè)方法，但目前，這種快速檢測(cè)方法不能滿足發(fā)酵食品中EC限量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定要求。

2.4 核磁共振分光檢測(cè)法

MONAKHOVA Y B等[24]利用偏最小二乘回歸結(jié)合核磁共振色譜，建立了一種檢測(cè)核果類飲料中EC含量的方法，該方法的靈敏度和特異性均要高于基于近紅外光譜或傅里葉變換紅外光譜建立的篩選技術(shù)，其準(zhǔn)確度足夠用于定量檢測(cè)含0～1mg/L范圍（歐洲委員會(huì)推薦）氨基甲酸乙酯的樣品。

與氣相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜方法相比，該方法省時(shí)，除了與含有內(nèi)標(biāo)的緩沖溶液混合之外，該方法甚至無需額外的樣品制備步驟，但該方法所需儀器設(shè)備昂貴，維護(hù)成本高。

2.5 時(shí)間分辨熒光免疫分析方法

徐巖等[25]以氨基甲酸乙酯-牛血清白蛋白作為免疫原獲得多克隆抗體，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白為包被抗原，利用制備的抗氨基甲酸乙酯多克隆抗體，用Eu3+標(biāo)記的羊抗兔抗體進(jìn)行示蹤，建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析方法用以檢測(cè)酒類中氨基甲酸乙酯的殘留，該方法的靈敏度為3.26μg/L，平均回收率為92.4%，同一批次內(nèi)和不同批次間檢測(cè)的變異系數(shù)分別為3.3%和6.7%，檢測(cè)范圍為1μg/mL～20μg/mL。該方法與甲氨、刀豆氨酸等存在一定程度的交叉反應(yīng)，檢測(cè)的特異性有待進(jìn)一步提高。

3 結(jié)論

氨基甲酸乙酯的傳統(tǒng)檢測(cè)方法盡管具有很高的靈敏度和可靠性，但也存在一些缺陷：樣品預(yù)處理的程序比較復(fù)雜，檢測(cè)成本高，時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)過程只能在具有大型、貴重儀器的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，難以適應(yīng)市場(chǎng)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)抽查、生產(chǎn)企業(yè)的自查及產(chǎn)品進(jìn)出口快速通關(guān)檢測(cè)的要求[26]。建立無損傷檢測(cè)方法及研發(fā)方便實(shí)用的快速檢測(cè)試劑盒是發(fā)酵食品中EC含量檢測(cè)迫切需要解決的問題[27]。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)具有特異性高、靈敏度高、快速簡(jiǎn)單、成本劃算等優(yōu)點(diǎn)[28]，可作為色譜和光譜等分析方法的補(bǔ)充，尤其是其能同時(shí)檢測(cè)大批量樣品、具有高通量篩選的能力，成為定性篩選和定量分析的工具，顯示出替換傳統(tǒng)儀器分析的應(yīng)用前景[29]，能為發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯殘留的高通量快速檢測(cè)提供簡(jiǎn)單有效的途徑。

隨著細(xì)胞融合技術(shù)、DNA重組技術(shù)、單鏈重組抗體技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)等抗體制備技術(shù)的飛速發(fā)展，人們開始用基因工程的方法制備基因重組抗體。氨基甲酸乙酯酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)以其自身的優(yōu)勢(shì)和在方法上的不斷完善，必將在氨基甲酸乙酯的快速檢測(cè)方面發(fā)揮愈來愈重要的作用。

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