煙草突變體篩選與鑒定方法篇：6.煙草T-DNA激活標(biāo)簽突變體側(cè)翼序列篩選與鑒定

崔萌萌

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

通過激活標(biāo)簽技術(shù)（activation tagging）得到突變?nèi)后w是構(gòu)建突變體庫(kù)的一種重要方法，應(yīng)用此種方法研究基因功能，不管是用正向或反向遺傳學(xué)方法，都必須先獲得插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列（flanking sequence）。隨著擬南芥、水稻及煙草等作物的側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善及煙草全基因組測(cè)序的完成，越來越體現(xiàn)出激活標(biāo)簽技術(shù)對(duì)于推動(dòng)煙草功能基因組學(xué)研究具有巨大的潛力。

1 T-DNA激活標(biāo)簽插入群體構(gòu)建

T-DNA激活標(biāo)簽技術(shù)是從早期的T-DNA標(biāo)簽技術(shù)發(fā)展改良而來的，早期的T-DNA標(biāo)簽技術(shù)是將人工構(gòu)建的T-DNA通過Ti或Ri質(zhì)粒攜帶，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法[1]隨機(jī)插入到植物基因組中，通常得到的是功能缺失型突變體，并不適于功能冗余基因、多發(fā)育階段作用基因、環(huán)境變化相關(guān)基因的研究。T-DNA激活標(biāo)簽是在 T-DNA的邊界加入強(qiáng)啟動(dòng)子或多個(gè)串聯(lián)增強(qiáng)子，從而增強(qiáng)插入?yún)^(qū)附近（上游或下游）基因的表達(dá)，產(chǎn)生顯性功能獲得型（dominant gain of function）突變體，且這種突變是可穩(wěn)定遺傳的。通過對(duì)激活標(biāo)簽載體T-DNA區(qū)加入篩選標(biāo)記（如抗除草劑Basta的Bar基因和抗卡那霉素的nptH基因）[2]可以篩選陽性植株。當(dāng)激活標(biāo)簽插入到基因內(nèi)部時(shí)也會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)插入失活突變體。2012年采用葉盤轉(zhuǎn)化法通過農(nóng)桿菌侵染將激活標(biāo)簽載體pSKI015轉(zhuǎn)入煙草品種紅花大金元中，獲得了具有Basta抗性的轉(zhuǎn)基因突變體T0代近4萬份。

2 激活標(biāo)簽突變體的初步篩選

由于通過激活標(biāo)簽技術(shù)產(chǎn)生的功能獲得型突變體表型為顯性，所以在當(dāng)代即可進(jìn)行初步的表型篩選，通過觀察得到一些外觀性狀明顯的突變表型；香氣、煙堿等性狀突變需要專業(yè)人員進(jìn)行分析或測(cè)定；一些肉眼不可見的形態(tài)突變要借助顯微觀察等方法。

3 側(cè)翼序列的篩選

激活標(biāo)簽插入突變體側(cè)翼序列篩選一般通過以下步驟進(jìn)行：（1）突變?nèi)后w基因組DNA提取、DNA定性及定量分析；（2）DNA 樣品的陽性檢測(cè)；（3）側(cè)翼序列擴(kuò)增；（4）瓊脂糖電泳檢測(cè)；（5）特異性側(cè)翼序列擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析。

激活標(biāo)簽突變體側(cè)翼序列擴(kuò)增的方法主要有：熱不對(duì)稱交錯(cuò) PCR法（thermal asymmetric interlaced-PCR，TAIL-PCR）[3-4]，PCR 步移（PCR-walking）[5]，F(xiàn)PNI-PCR[6]等。

TAIL-PCR方法的原理是根據(jù)激活標(biāo)簽載體T-DNA區(qū)的左邊界設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物，用它們分別與低Tm值的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物結(jié)合，第一輪反應(yīng)以基因組DNA為模板，根據(jù)引物長(zhǎng)短和特異性的不同設(shè)計(jì)熱不對(duì)稱的循環(huán)，通過分級(jí)反應(yīng)來得到特異性產(chǎn)物。

PCR-walking方法是利用產(chǎn)生平滑末端的限制性內(nèi)切酶（轉(zhuǎn)基因元件里不應(yīng)存在酶切位點(diǎn)）消化基因組DNA，并與設(shè)計(jì)好的接頭相連接，設(shè)計(jì)T-DNA特異性和接頭特異性的引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再用一對(duì)嵌套的特異性引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，從而獲得特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。

FPNI-PCR方法通常需要三輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)和TAIL-PCR一樣運(yùn)用熱不對(duì)稱原理，第二和第三輪反應(yīng)運(yùn)用高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)選擇性地?cái)U(kuò)增出特異性產(chǎn)物。

4 突變基因功能鑒定

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的激活標(biāo)簽插入在轉(zhuǎn)基因植物中多為單拷貝，且能穩(wěn)定遺傳，通過實(shí)驗(yàn)確定其是單拷貝后那正常情況下它就是導(dǎo)致插入突變的突變?cè)璠7]，其后代符合孟德爾遺傳定律。從突變?nèi)后w中篩選到具有突變表型的株系后，通過T-DNA插入序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步判斷突變性狀是否與插入事件共分離，再通過側(cè)翼序列與突變性狀的共分離檢測(cè)來確定突變是否是由 T-DNA插入引起的。測(cè)序獲得目標(biāo)株系插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列信息，通過與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)比對(duì)來判斷激活標(biāo)簽的插入位點(diǎn)，確定候選基因[8]。通過將候選基因的野生型拷貝轉(zhuǎn)化入突變株進(jìn)行過量表達(dá)，觀察其表型恢復(fù)情況，或采用RNAi等方法進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。為保證遺傳分析的準(zhǔn)確性，每代每個(gè)株系群體應(yīng)保持相應(yīng)的數(shù)量，由于激活標(biāo)簽法產(chǎn)生的是顯性功能獲得型突變體，純合體的獲得需要多年自交篩選。

激活標(biāo)簽技術(shù)已經(jīng)在擬南芥和水稻中得到了廣泛的應(yīng)用，在煙草中也有成功的應(yīng)用。Hayashi等[9]首先在煙草中成功使用帶有4個(gè)CaMV35S增強(qiáng)子[10]的激活標(biāo)簽，得到了不需要外源生長(zhǎng)素就可以生長(zhǎng)的愈傷組織突變體。Weigel等[2]用T-DNA激活標(biāo)簽技術(shù)創(chuàng)建擬南芥突變?nèi)后w，分析鑒定了30個(gè)不同表型的顯性突變體，RT-PCR表明插入位點(diǎn)附近的基因過量表達(dá)。Jeong等[11]構(gòu)建了一個(gè)T-DNA中含有CaMV35S增強(qiáng)子的質(zhì)粒載體pGA2715，并用該載體構(gòu)建了含有13 450個(gè)獨(dú)立的水稻T-DNA插入標(biāo)簽系，反轉(zhuǎn)錄PCR分析表明，約40%的T-DNA插入株系中與插入位點(diǎn)相鄰的基因表達(dá)明顯增加，但不一定能產(chǎn)生明顯的表型變化。

5 問題與展望

整合到基因組的 T-DNA一旦出現(xiàn)多拷貝插入，就會(huì)對(duì)基因分離和性狀分離造成麻煩，而且組培過程中也會(huì)產(chǎn)生突變，這些都增加了基因功能的分析難度。有研究表明，T-DNA并不是完全隨機(jī)插入，而是優(yōu)先插入到轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域[12]，且在某些情況下由激活標(biāo)簽引起的表型經(jīng)過幾代會(huì)消失，這可能是由于插入的T-DNA或者側(cè)翼序列甲基化導(dǎo)致的[13-14]。雖然存在著一些問題，但T-DNA激活標(biāo)簽法還是植物基因功能研究的一個(gè)極具潛力的研究方法。

[1]李子銀，胡會(huì)慶.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，1998，18（l）：22-26.

[2]Weigel D, Ahn J H, Blazquez M A, et al.Activation tagging in Arabidopsis[J].Plant Physiol, 2000, 122: 1003-1013.

[3]Liu Y G, Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J].Genomics, 1995, 25: 674-681.

[4]Liu Y G, Chen Y L.High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J].Biotechniques, 2007, 43: 649-656.

[5]Balzergue S, Dubreucq B, Chauvin S, et al.Improved PCR-walking for large-scale isolation of plant T-DNA borders[J].Biotechniques, 2001, 30: 496-498.

[6]Wang Z, Ye S F, Li J J, et al.Fusion primer and nested integrated PCR (FPNI-PCR): a new high-efficiency strategy for rapid chromosome walking or flanking sequence cloning[J].BMC Biotechnology, 2011, 11: 109.

[7]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2002：220-221.

[8]代曉霞.水稻T-DNA插入突變體庫(kù)側(cè)翼序列的分離和OsBC1L家族基因的功能研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[9]Hayashi H, Czaja I, Lubenow H, et al.Activation of a plant gene by T-DNA tagging: auxin-independent growth in vitro[J].Science, 1992, 258: 1350-1353.

[10]Odell J T, Nagy F, Chua N H.Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter[J].Nature, 1985, 313: 810-812.

[11]Jeong D H, An S, Kang H G, et al.T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in Rice[J].Plant Physiol, 2002, 130(4):1636-1644.

[12]Brunaud V, Balzergue S, Dubreucq B, et al.T-DNA integration into the Arabidopsis genome depends on sequences of pre-insertion sites[J].EMBO Rep, 2002, 3: 1152-1157.

[13]Finnegan E J, Genger R K, Peacock W J, et al.DNA methylation in plants[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1998, 49:223-247.

[14]Fagard M, Vaucheret H.(Trans)gene silencing in plants: How many mechanisms?[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,2000, 51: 167-194.