蛋白質組學在糖尿病視網膜病變中的研究現(xiàn)狀

張世陽，高海青

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年病科，合肥230001;2.山東大學齊魯醫(yī)院老年病科、山東省心血管病蛋白質組學重點實驗室)

人類基因組工作框架圖的完成，標志著生命科學的研究進入后基因組時代。研究的重點從作為遺傳信息的載體—基因，逐漸轉向生理活動的執(zhí)行者—蛋白質。人們認識到，只有對蛋白質的數(shù)量、結構、性質、相互關系以及其生物功能的全面了解，才能闡明生命活動的規(guī)律，揭示生命現(xiàn)象的本質。蛋白質組學這一新興學科應運而生［1］。糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病(DM)最常見與最嚴重的并發(fā)癥之一，也是目前世界范圍內主要致盲原因之一。蛋白質組學的興起為DR的研究提供了嶄新的途徑，可以幫助闡明DR的發(fā)病機制、篩選特異性生物標志物與尋找藥物靶標等。因此，蛋白質組學在DR的研究中越來越受到重視。

1 蛋白質組與蛋白質組學的概念

1994 年澳大利亞學者 Wilkins與 Williams［2］首先提出了蛋白質組(proteome)的概念。這是由英文蛋白質(protein)與基因組(genome)組合而成的新的英文名詞。自此之后，蛋白質組成為生命科學研究的新領域。

蛋白質組是指一個細胞或組織基因組所表達的全部蛋白質。蛋白質組學則為一衍生概念，是從整體的角度分析細胞或組織的動態(tài)變化的蛋白質組成成分、表達水平、翻譯后修飾狀態(tài)以及蛋白質之間的相互作用，揭示蛋白質功能與細胞生命活動的規(guī)律，進而了解疾病的發(fā)生與發(fā)展。

2 蛋白質組學的研究內容

目前蛋白質組學的研究內容主要分為兩部分，一是表達蛋白質學，為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質組研究技術分析生物體內盡可能多乃至接近所有的蛋白質。如我國科學家團隊于2002年率先組織實施的“人類肝臟蛋白質組計劃”。這種蛋白質表達法研究大規(guī)?；?、系統(tǒng)化，理論上符合蛋白質組學的本質，但實際操作中由于蛋白質的動態(tài)變化，實現(xiàn)目標往往比較困難。二是差異蛋白質學，為“功能法”，即研究不同時間與空間下細胞蛋白質組成的變化，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質組學種類為主要目標，其特點在于其更高的可行性，并且反映了蛋白質的動態(tài)本質，因此具有廣泛和明確的應用前景。近年來蛋白質組學的研究范圍也在不斷的完整與補充，如修飾蛋白質學、定量蛋白質學等。

3 糖尿病視網膜病變的蛋白質組學研究

DR是DM最為常見的慢性并發(fā)癥之一，是目前主要致盲眼病之一。資料顯示［3］，我國DM患者中DR患病率為25.2%，而且初次診斷的2型DM患者中DR患病高達12.4%。傳統(tǒng)的研究手段已經初步揭示了DR的病因與發(fā)病機制，但仍缺乏對其復雜的分子機制的認識，限制了DR診治水平的提高。蛋白質組學的興起為探討DR的病理生理機制以及新藥開發(fā)提供了廣闊的平臺，為DR的臨床診治上帶來嶄新的視角與手段。目前蛋白質組學已經應用于DR病變這一領域并取得一定的成果。

3.1 蛋白質組學在DR相關的體外培養(yǎng)細胞的應用 人視網膜色素上皮細胞(RPE)的遷移、去分化以及增殖在DR病變中具有重要作用，成為近年來研究DR等眼底病變的切入點之一。West等［4］將人RPE細胞制備成亞細胞標本，利用蛋白質組學技術首次對人RPE細胞蛋白質組進行分析，共分離檢測得到278種蛋白質，大部分為管家蛋白，另外包括細胞視黃醛結合蛋白、細胞視黃醛連接蛋白、光間受體視黃類結合蛋白等以及與視覺功能相關的蛋白。Alge等［5］運用2-DE/MS研究了自然分化的RPE細胞以及體外培養(yǎng)去分化的RPE細胞的差異蛋白質，結果顯示在培養(yǎng)的去分化RPE細胞中吞噬功能蛋白如網格蛋白、組織蛋白酶D等并未變化，但與細胞形狀等形成蛋白如細胞角蛋白19、肌動蛋白以及肌凝蛋白表達上調，與細胞增殖有關蛋白如翻譯起始因子、鈣依賴蛋白也有所上調，而與RPE細胞視覺功能相關蛋白如細胞視黃醛結合蛋白、細胞視黃醛連接蛋白表達則明顯下調，提示RPE細胞的體外去分化可能觸動了視網膜病變的發(fā)生。在直接研究DM患者RPE蛋白質組學上，新近有學者作了有益的嘗試。Decanini等［6］分離了無 DR臨床癥狀的DM患者的RPE細胞，應用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF/MS技術，并與年齡匹配捐助眼來源RPE細胞比較，共發(fā)現(xiàn)31種差異蛋白質，鑒定出18個差異蛋白，其中15個表達上調，3個表達下調。差異蛋白功能主要涉及能量代謝與伴侶蛋白，另外包括有脂質氧化、細胞骨架、視網膜代謝以及運輸合成蛋白等，考慮到RPE細胞在視網膜疾病中的重要性，該實驗結論有助于進一步探索與揭示早期DR的病理機制。

3.2 蛋白質組學在DR動物模型中的應用

3.2.1 DR 動物模型蛋白質組的變化 Liu 等［7］使用2-DE技術比較了8周DM大鼠視網膜與正常SD大鼠視網膜蛋白質的變化，共檢測出DM大鼠視網膜36個差異蛋白，其中5個蛋白上調，23個下調，8個點消失。盡管作者未運用具體的蛋白質鑒定技術進行進一步探索，仍為國內開展蛋白質組學在DR中的研究作出了努力。王亞冬等［8］用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠2型DM模型，利用2-DE技術分離DM視網膜，與正常組比較，表達明顯差異的約150個蛋白質，上調點68個，下調點82個。他們進一步應用 MALDITOF/MS與串聯(lián)質譜(MS/MS)鑒定發(fā)現(xiàn)10個為新發(fā)現(xiàn)蛋白，其功能涉及糖脂代謝、炎性反應、NO合成酶途徑以及細胞骨架蛋白與分子伴侶蛋白等，隨后采用蛋白印跡技術驗證了其中αA晶體蛋白，提示其在DM視網膜上明顯表達上調。

3.2.2 藥物干預對DR動物模型蛋白質組的影響目前觀點認為［9］，差異表達的蛋白很有可能參與了DR的發(fā)生發(fā)展，而應用藥物干預后能夠回調的蛋白則具有巨大的臨床實用價值，可以作為DR的分子標記，以及作為今后治療和設計更為有效的藥物靶標。國內高海青課題組率先開展了此方面研究，并取得了重大成果。他們選擇天然藥物葡萄籽原花青素提取物(GSPE)治療DM大鼠并進行蛋白質組學研究，結果發(fā)現(xiàn)，與DM模型組比較，GSPE干預組7個蛋白回調至正常水平，分別是αB-晶狀體蛋白、βA4-晶狀體蛋白、αA-晶狀體蛋白、泛素羧基末端水解酶-L1、G蛋白-β1、IgG-2A與丙酮酸激酶。該研究提示晶狀體蛋白的高表達參與了DR的發(fā)生與發(fā)展，GSPE干預的抑制作用可能減緩DR的進展;而泛素羧基末端水解酶-L1、G 蛋白-β1、IgG-2A與丙酮酸激酶在DM視網膜表達下調，其功能涉及細胞周期調控、細胞增殖、跨膜信號轉導、氧化應激等，GSPE干預的恢復作用有助于 DR的改善［10］。Gao等［11］應用血管緊張素受體Ⅰ拮抗劑坎地沙坦干預STZ誘導建立的DM小鼠模型，利用LC-MS/MS技術比較干預前后蛋白質組學變化，結果發(fā)現(xiàn)與非DM組比較，DM小鼠視網膜組有65個蛋白質發(fā)生2倍以上的改變，其中的72%經過坎地沙坦干預后可以回調。這些蛋白與代謝、氧化應激以及凋亡等功能有關，并可能參與DR的發(fā)展，而血管緊張素受體Ⅰ拮抗劑坎地沙坦可能有助于DR的治療。胰島素是治療糖尿病的重要藥物之一，研究胰島素治療前后蛋白質組的變化有利于真實世界中從蛋白質水平上深入理解DR的病理生理機制。新近VanGuider等［12］同時采用多種蛋白質組學技術(抗體Luminex、DIGE與 LS-MS/iTRAQ)研究 DM 大鼠視網膜病變蛋白質的變化，并使用胰島素干預，結果提示，干預后地西泮結合抑制蛋白、膜聯(lián)蛋白5等蛋白恢復正常，而血漿銅藍蛋白、晶狀體蛋白β3、可溶性半乳糖苷結合凝集素3以及信號轉導子和轉錄激活子3等蛋白部分恢復正常，成纖維細胞生長因子2與晶狀體蛋白β2的上調則未受任何影響。作者認為，胰島素干預后未能回調至正常的蛋白可能在DR發(fā)病機制的“代謝記憶”中發(fā)揮作用，并為DR的治療藥物的選擇提供了全新思路。

3.3 蛋白質組學在DR患者中的應用

3.3.1 DR患者玻璃體液蛋白質組研究 玻璃體與視網膜結構密切，眼底視網膜的病變往往反應于玻璃體液的改變，同時玻璃體液的取材技術方便，目前玻璃體液成為了研究DR患者蛋白質組學的主要研究對象。

Bresgen等［13］開始利用2-DE分析增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)患者的玻璃體蛋白成分與正常人玻璃體以及血清蛋白的不同。研究結果顯示，正常的玻璃體內最常見的蛋白質為白蛋白、轉鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶、免疫球蛋白與前清蛋白等。PDR玻璃體樣本中，轉鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶與前清蛋白的含量下降，而免疫球蛋白水平升高，更類似于血清蛋白的構成，提示PDR已經發(fā)生血-視網膜屏障的破壞。另外，新發(fā)現(xiàn)3種低分子量蛋白只出現(xiàn)在PDR玻璃體中，分析可能為玻璃體視網膜的增生反應導致的局部蛋白質的異常額外合成。隨著蛋白質組學技術的進步與完善，DR的功能蛋白質組也有了更多的發(fā)現(xiàn)。Gao等［14］利用 SDS-PAGE與LC-MS/MS技術比較了PDR的蛋白質變化，結果顯示，與DM患者但無視網膜病變者(NDR)比較，PDR患者玻璃體液中血管緊張原表達升高，而鈣結合蛋白-1、光間受體視黃醛結合蛋白與神經絲氨酸抑制蛋白明顯表達降低;與DM患者但無視網膜病變者以及非DM患者相比，PDR患者玻璃體液中氧化還原修飾酶-1表達增加，超氧化物歧化酶水平降低。該研究進一步開拓了對于DR特別是PDR的發(fā)病機制的理解。

由于黃斑裂孔(MH)病變影響玻璃體液的蛋白質成分可能性小，而且取樣更符合倫理學原則，因此目前研究中MH往往作為DR蛋白質組學研究的對照組。Nakanishi等［15］運用2-DE與MS分析比較了DR和MH患者玻璃體內可溶性蛋白的不同。共檢測出52種不同的蛋白。與MH患者相比，DR患者玻璃體中免疫球蛋白、α1-胰蛋白酶、α2-硫酸肝素糖蛋白與補體C4等蛋白豐度表達增高。同時在DR患者玻璃體中檢出色素上皮源性因子(PEGF)。作者認為，這種強有力的新生血管抑制因子PEGF出現(xiàn)在以增生性新生血管為特征的DR患者玻璃體中，是否代表著玻璃體微環(huán)境平衡打破后的自身代償與恢復機制，而能否將其當作增生性DR治療的又一方向，尚待進一步探討。隨后Yamane等［16］分別將DR與MH患者的玻璃體與各自相對應的血清進行蛋白質成分比較，發(fā)現(xiàn)烯醇化酶與過氧化氫酶在DR患者血清中未檢出，在MH玻璃體中為陰性，僅僅出現(xiàn)于DR患者的玻璃體中，提示兩者與DR的發(fā)生相關。新近Garcia-Rameriez等［17］應用DIGE技術分析PDR患者與MH患者的蛋白質差異。共檢出差異蛋白點41個，其中28個上調，13個下調。共鑒定出11種蛋白，其中上調蛋白8種，分別為鋅α2-糖蛋白、載脂蛋白A-I、載脂蛋白H、纖維蛋白原A、補體 C3，C4b，C9以及補體因子 B;下調蛋白3種，則是色素上皮衍生因子、間質性視黃醇結合蛋白與α胰蛋白酶抑制劑重鏈前體。作者并且采用蛋白印跡以及實時PCR技術驗證了鋅α2-糖蛋白、補體C3、補體因子B、色素上皮衍生因子與間質性視黃醇結合蛋白。這些蛋白與抑制細胞增殖、激活補體系統(tǒng)、新生血管形成以及視色素的再生等有關，參與了DR的病理機制。該課題組還作了進一步研究［18］，結果顯示，光間受體視黃醛結合蛋白在 DR早期階段明顯下調，其與視網膜神經變性有關;而載脂蛋白A-I與載脂蛋白H則在PDR患者中明顯上調，前者可能有抗氧化應激作用，后者可能有防止細胞凋亡功能。

3.3.2 DR 患者視網膜蛋白質組研究 Ann 等［19］應用免疫印跡方法分析PDR患者、NPDR患者、DM患者與正常對照者血清以及正常對照者視網膜可溶性蛋白質的變化，并采用2-DE和ESI-MS/MS進行鑒定，繼而運用兔醛縮酶進行免疫印跡檢測以篩選DR的自身血清抗體，并以ELISA檢測抗體滴度。結果證實，與DR患者血清反應的20個蛋白點，其中14個蛋白點只發(fā)現(xiàn)于DR患者血清，4個蛋白點在PDR患者與NPDR患者血清中均存在。研究還顯示，DR血清中的確存在一種抗醛縮酶-C抗體高表達，其滴度顯著高于正常對照者以及未發(fā)生視網膜病變的DM患者，但PDR患者與NPDR患者中抗醛縮酶-C抗體滴度無顯著差異。作者分析，基于醛縮酶-C只出現(xiàn)于腦部在神經元表達，其自身抗體出現(xiàn)說明DR患者血-視網膜屏障的破壞，提示抗醛縮酶-C抗體可作為一種DR的診斷性標記物進行臨床檢測。該研究提出了自身免疫機制可能也參與了DR的病理過程，拓寬了DR研究的新觀點。

4 小結

綜上所述，通過蛋白質組學方法在DM研究中的應用，已部分揭示了DR的病理生理機制，發(fā)現(xiàn)了一些與DR的相關蛋白，展示了蛋白質組學技術在DR研究中的應用前景。相信隨著蛋白質組學技術的不斷進步，勢必更加完善DR發(fā)病機制的詮釋，更好地診治DR。

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