柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定新疆金雞菊中游離氨基酸

馬曉麗，趙東升，孫自增，李新霞，毛新民

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心，新疆烏魯木齊830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830000)

金雞菊Coreopsis basalis又名昆侖雪菊，屬菊科金雞菊屬Coreopsis的干燥頭狀花序［1］。目前在新疆和田地區(qū)種植較為廣泛，是維吾爾族世代傳承下來(lái)的一種養(yǎng)生、保健的天然植物。新疆維吾爾醫(yī)院也將其作為一種維藥材應(yīng)用，民間將其當(dāng)茶飲用，有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效。藥理實(shí)驗(yàn)也證明新疆金雞菊對(duì)冠心病、高血脂、糖尿病均有特殊的療效［2-4］。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金雞菊中主要含有黃酮、揮發(fā)油、多糖和氨基酸等活性成分，目前還沒(méi)有金雞菊質(zhì)量控制的藥材標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)［5］采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析了新疆金雞菊中總氨基酸的含有量，但該方法所用試劑量大、測(cè)試成本較高，且分析得出的是蛋白水解后的氨基酸含有量，缺乏準(zhǔn)確性。近年來(lái)高效液相色譜法成為檢測(cè)氨基酸的重要方法［6-8］，本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生高效液相色譜法分析新疆金雞菊中主要游離氨基酸的含有量，嘗試通過(guò)對(duì)其中多種游離氨基酸進(jìn)行檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)新疆金雞菊藥材的質(zhì)量，為新疆金雞菊中氨基酸成分的研究提供參考。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters e2695，UV-2489紫外檢測(cè)器，色譜柱(Shim-pack VP-ODS，4.6 mm×25 cm，5 μm)，Empower 3色譜工作站;分析天平(Sartorius，BS110S，d=0.1 mg);氮吹儀(天津恒奧科技，HSC-12A);快速混勻器(金壇市醫(yī)藥儀器廠，SK-1)。

氨基酸對(duì)照品天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Aspa)絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)色氨酸(Trp)、賴氨酸(Lys)(生化試劑，純度均大于98%)乙酸鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工廠，優(yōu)級(jí)純);正己烷、三乙胺(TEA)(天津市富宇化工有限公司，分析純);異硫氰酸苯酯(PITC)(上海金山亭新化工公司);乙腈和甲醇為色譜純;milli-Q超低有機(jī)物超純水機(jī)制備超純水(美國(guó)Millipore公司生產(chǎn))。

金雞菊樣品采自新疆和田地區(qū)，由新疆雪菊生物科技公司提供，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍博士鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液配制分別精密稱取18種氨基酸對(duì)照品適量，置于同一25 mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶解并定容至刻度，作為氨基酸貯備溶液。

2.1.2 供試品溶液配制精密稱定和田地區(qū)金雞菊樣品粉末(40目)約2.0 g。加水40 mL，浸泡1 h，100 kHz 60℃超聲提取30 min，過(guò)濾，濾渣同上方法再次提取，過(guò)濾，合并濾液，低壓旋轉(zhuǎn)濃縮后定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為0.04 g/L的供試品溶液。

2.2 衍生化反應(yīng)

2.2.1 衍生化試劑配制

1 mol/L三乙胺乙腈溶液∶取三乙胺1.3 mL，加乙腈定容至10 mL量瓶中，混勻備用。

0.1 mol/LPITC乙腈溶液:取PITC 0.3 mL，加乙腈定容至25 mL量瓶中，混勻備用。

2.2.2 對(duì)照品和供試品衍生化取對(duì)照品溶液和供試品溶液200 μL，加入0.1 mol/L PITC乙腈溶液100 μL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，渦旋混勻，室溫放置20 min，加入正己烷500 μL，充分震搖混勻后，10 000 r/min離心5 min，分層后，吸取下層溶液(正己烷萃取2次)，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，備用。以水作為陰性對(duì)照溶液，同法進(jìn)行衍生。

2.3 色譜條件色譜柱:Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6mm×25 cm，5 μm，島津);流動(dòng)相A:稱取15.2 g無(wú)水乙酸鈉，加水1 850 m L，溶解后用冰醋酸調(diào)pH值6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B:甲醇-乙腈-水=(20∶60∶20)，梯度洗脫見(jiàn)表1;體積流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 μL。

表1 梯度洗脫程序

取衍生化后的對(duì)照品、樣品及陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)保留時(shí)間可見(jiàn)新疆金雞菊中主要氨基酸。各氨基酸的理論塔板數(shù)均不低于5 000。

3 結(jié)果與討論

3.1 專屬性考察在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品色譜圖見(jiàn)圖1(A、B、C)。由圖可見(jiàn)18種氨基酸在35 min內(nèi)基本達(dá)到了完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)和衍生化試劑不干擾氨基酸的測(cè)定。

圖1 HPLC色譜圖

3.2 線性考察分別精密量取氨基酸混合對(duì)照品溶液0.20、0.5、1、2、3、4、5 mL各置10 mL量瓶中，用水定容至刻度，得到7種不同質(zhì)量濃度的氨基酸對(duì)照品混合溶液。按照2.2項(xiàng)下衍生后測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 18種氨基酸的線性方程

3.3 方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液200 μL，按照2.2.2項(xiàng)方法衍生后連續(xù)進(jìn)樣5次，以及分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以色譜峰峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察其精密度和穩(wěn)定性，18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度試驗(yàn)RSD在0.26%～3.43%(n=5);衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD在2.28%～3.58%(n=5)。取同一批金雞菊干燥粉末5份，按2.1.2項(xiàng)方法提取、2.2.2項(xiàng)下衍生、測(cè)定，以色譜峰峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性，各氨基酸峰面積的RSD在2.85%～3.97%。

3.4 回收率試驗(yàn)精密稱取已知含有量的同一批次金雞菊樣品6份，準(zhǔn)確加入一定量的氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.2.2項(xiàng)方法衍生、進(jìn)樣，外標(biāo)法定量，平行5次，計(jì)算各氨基酸的回收率和RSD。樣品測(cè)定結(jié)果表明，由于樣品中只有12種氨基酸被準(zhǔn)確檢出并定量，因此本實(shí)驗(yàn)只計(jì)算了12種氨基酸的平均回收率，在94.08%～105.3%之間;RSD在0.96%～2.97%。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.5 樣品測(cè)定取衍生好的樣品溶液200 μL，按照上述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量，樣品測(cè)定結(jié)果表明，新疆金雞菊中的游離氨基酸主要以脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸為主，占游離氨基酸總量的79.2%，其次是胱氨酸、絲氨酸、纈氨酸等，樣品中谷氨酸、組氨酸、絡(luò)氨酸、蛋氨酸未達(dá)到檢出限，而苯丙氨酸在線性以下，未能定量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 樣品中各個(gè)氨基酸的加標(biāo)回收率(n=5)

表4 不同地區(qū)氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3)

4 討論

氨基酸柱前衍生主要采用的衍生化試劑有異硫氰酸苯酯(PITC)和鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)、丹酰氯等，根據(jù)本組的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OPA衍生法雖然快速，但衍生產(chǎn)物極不穩(wěn)定，很容易降解，而丹酰氯法需要水浴反應(yīng)，較麻煩。因此本實(shí)驗(yàn)采用異硫氰酸苯酯進(jìn)行氨基酸的衍生，反應(yīng)生成苯氨基硫甲酰衍生物(phenylthiocarbamylaminoacide，PTC-AA)，本方法靈敏度高，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定、單一，衍生試劑雜質(zhì)峰不干擾測(cè)定，結(jié)果18種氨基酸對(duì)照品在35 min內(nèi)能夠完全分離，適用于新疆金雞菊中游離氨基酸的快速測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相梯度比例，不同反應(yīng)時(shí)間及不同萃取次數(shù)對(duì)衍生產(chǎn)物的影響，結(jié)果根據(jù)色譜柱情況調(diào)整了梯度比例后，可以有效的分離各氨基酸，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了不同衍生時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)室溫衍生20 min、30 min及1 h對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積影響不大，因此選用室溫反應(yīng)20 min對(duì)氨基酸進(jìn)行測(cè)定，還考察了多次溶劑萃取對(duì)衍生產(chǎn)物的影響，由于衍生試劑對(duì)色譜柱有一定的損害，當(dāng)用正己烷進(jìn)行多次萃取后發(fā)現(xiàn)萃取次數(shù)對(duì)氨基酸的峰面積影響不大，但可以有效減少衍生試劑的殘留，同時(shí)可以減少其對(duì)色譜柱的損害，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，因此最后本實(shí)驗(yàn)選用樣品與衍生試劑室溫反應(yīng)20 min，正己烷萃取2次后進(jìn)樣分析測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆不同地區(qū)的金雞菊中游離氨基酸含有量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有量最高的氨基酸為脯氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，三者之和占到總氨基酸量的76.05%～79.41%;不同地區(qū)的金雞菊中氨基酸含有量稍有差異，根據(jù)結(jié)果新疆和田的皮山地區(qū)金雞菊中游離氨基酸含有量均較高，可能與該地區(qū)地理位置，種植品種(系)及生態(tài)環(huán)境尤其其海拔有一定關(guān)系。本方法準(zhǔn)確，可靠、經(jīng)濟(jì)，能用于新疆金雞菊藥材中氨基酸的測(cè)定。

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