重慶后山梔子的UPLC-PDA指紋圖譜研究

陳紹成，石燕紅，楊娜，王瑞*

(1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203)

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩，清熱利尿，涼血解毒的功效，用于熱病心煩、黃疸尿赤、血淋澀痛、血熱出衄、目赤腫痛、火毒瘡傷、外治扭挫傷痛［1］。

已有文獻(xiàn)報(bào)道梔子的化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、西紅花(藏紅花)苷類、黃酮類等［2-4］，具有保肝利膽、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用［4-6］。以梔子苷、西紅花苷-1為代表的環(huán)烯醚萜類和西紅花苷類成分是梔子中公認(rèn)的主要活性成分，目前對梔子及其加工炮制品的質(zhì)量控制主要是根據(jù)這兩類化合物含有量高低來進(jìn)行評價(jià)［1，7-9］。

由于梔子品種比較復(fù)雜，市場上常以茜草科梔子屬其它植物的果實(shí)冒充正品梔子出售［10-11］。近幾年來，四川、重慶地區(qū)市售梔子均來自重慶市萬州區(qū)后山鎮(zhèn)，但該地所產(chǎn)梔子成熟果實(shí)超過半數(shù)明顯大于現(xiàn)行2010年版《中國藥典》梔子“性狀”項(xiàng)下規(guī)定的長1.5 cm～3.5 cm和直徑1 cm～1.5 cm，當(dāng)?shù)厮幧陶J(rèn)為其性狀不符合藥典規(guī)定，市場銷售前景不佳，使得重慶后山地區(qū)梔子栽培面積大大減少，對當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了較大的影響。為了盡快推進(jìn)重慶地區(qū)中藥特色經(jīng)濟(jì)，保護(hù)梔子種質(zhì)資源，有必要對該地區(qū)梔子作進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)連續(xù)收集2009年—2011年重慶后山梔子9批，按梔子果實(shí)大、小分類;同時(shí)收集梔子對照藥材、市售梔子和焦梔子各3批(非重慶后山產(chǎn))，采用可變波長法，建立了超高效液相色譜指紋圖譜分析方法，并結(jié)合化學(xué)統(tǒng)計(jì)方法(SA、PCA)，旨在通過比較與分析重慶后山梔子與其他產(chǎn)地梔子及梔子炮制品樣品間的差異，來綜合評價(jià)重慶后山產(chǎn)梔子的內(nèi)在質(zhì)量，為當(dāng)?shù)卣块T發(fā)展梔子產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支撐，且為其梔子人工栽培以及進(jìn)一步的合理開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Introduces ACQUITY UPLC H-Class System(包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器、工作站);乙腈(色譜純，德國Merck公司);電子分析天平(AE200，瑞士METTLER TOLEDO公司)，KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈、磷酸(色譜純，Merck公司)，水為Milli-Q超純水(Millipore，美國Bedford公司);甲醇、乙醇等其它分析純試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國，上海)。

梔子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110749)，西紅花苷-1對照品(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，經(jīng)HPLC檢測，面積歸一化法計(jì)算，純度＞98%)。

本實(shí)驗(yàn)收集重慶后山梔子9批，按果實(shí)的外觀形態(tài)劃分為大、小2個級別［11］，其中大果實(shí)長度＞3.5 cm，直徑＞1.5 cm;小果實(shí)長度和直徑均符合現(xiàn)行2010年版《中國藥典》梔子“性狀”項(xiàng)下規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(S01～S18)，市售梔子藥材3批(S19～S21)，梔子對照藥材1批(S22)和市售焦梔子3批(S23～S25)。樣品和標(biāo)本由重慶第二師范學(xué)院陳紹成副教授和上海中醫(yī)藥大學(xué)石燕紅收集(表1)，藥材由上海中醫(yī)藥大學(xué)宋龍博士鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，標(biāo)本保存在上海中醫(yī)藥大學(xué)。樣品粉碎，過三號篩，抽真空保存。

2 方法

2.1 色譜條件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，0～4 min(8%～20%A)，4～11 min(20%～60%A);檢測波長238 nm(0～5 min)，440 nm(5～11min);體積流量0.3 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量2 μL。

表1 不同批次梔子樣品來源及相似度結(jié)果(n=2)Tab.1 Sample resources and the results of sim ilarity(n=2)

2.2 樣品溶液制備方法

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取梔子苷和西紅花苷-I對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含40 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備取梔子樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取梔子樣品(S01)粉末約0.5 g，精密稱定，按供2.2.2項(xiàng)操作，照2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次測定，結(jié)果表明，UPLC圖譜中各主要色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.19%，相對峰面積的RSD均小于2.45%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號梔子樣品(S01)粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)操作，照2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，UPLC圖譜中各主要色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.56%，相對峰面積的RSD均小于4.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一梔子樣品(S01)粉末約0.5 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)操作，照2.1項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，UPLC圖譜中各主要色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于0.55%，相對峰面積的RSD均小于3.89%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 梔子UPLC指紋圖譜建立標(biāo)準(zhǔn)采用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，建立了9批重慶后山梔子藥材(按果實(shí)大小分類)的UPLC指紋圖譜。以“對分類決策有影響的信息應(yīng)盡量保留，對分類決策無影響的信息應(yīng)盡量舍棄”的原則篩選了18個色譜峰;并采用對照品比對，峰6和峰11分別為梔子苷和西紅花苷-1。以特征性活性成分梔子苷(峰6)為參比峰，采用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2.0版”軟件生成模式指紋圖譜，手動標(biāo)定18個共有峰(圖1，圖2)，并采用SPSS 15.0和偏最小二乘法軟件(SIMCA-P 11.0)對其進(jìn)行化學(xué)統(tǒng)計(jì)方法分析。

3.2 指紋圖譜結(jié)果分析

3.2.1 相似度分析采用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2.0版”軟件生成標(biāo)準(zhǔn)對照圖譜，SFDA規(guī)定以所有色譜圖的相關(guān)系數(shù)和/或原始數(shù)據(jù)的夾角的余弦值計(jì)算其相似度，結(jié)果見表1。

3.2.2 主成分分析主成分分析是一種掌握主要矛盾的統(tǒng)計(jì)方法，通過線性變換將多變量指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾項(xiàng)綜合指標(biāo)，所得出的少數(shù)幾個主成分因子，要盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此不相關(guān)［15-16］。主成分分析和主成分負(fù)載圖結(jié)果見圖3和圖4。

4 結(jié)論與討論

4.1 檢測波長的選擇環(huán)烯醚萜類和西紅花苷類為梔子中兩大主要有效成分，最大吸收波長分別為238 nm和440 nm，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)以單波長238 nm和440 nm分別進(jìn)行了UPLC-PDA分析，對比分析所采集的UPLC圖譜得出:紫外吸收光譜掃描顯示環(huán)烯醚萜類成分主要集中在0～5 min，西紅花苷類成分集中在5～11 min，兩者無交叉吸收區(qū)域，據(jù)此，我們選用可變波長技術(shù)，分別在二者最大吸收波長處檢測，使兩者成分在同一指紋圖譜條件中呈現(xiàn)出來。本研究采用可變波長超高效液相色譜法首次建立了重慶后山產(chǎn)梔子的指紋圖譜，方法簡便，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

圖1 梔子對照品(A)與藥材(B)UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram s of referenu substances(A)and the samples of Gardeniae Fructus(B)

圖2 25批梔子樣品的UPLC-PDA指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprints of 25 batches of samp les of Gardeniae Fructus

圖3 主成分分析得分圖Fig.3 Scores plot obtained by PCA of the 25 samp les

圖4 主成分因子負(fù)載圖Fig.4 Loading plot from PCA for the common

4.2 相似度分析不同產(chǎn)地梔子藥材的相似度為0.977～0.998，表明在該指紋圖譜識別模式下所收集的重慶后山梔子藥材與市售的梔子藥材和對照藥材間差異性較小。焦梔子的相似度為0.955～0.957，表明焦梔子與梔子藥材間存在一定的差異，可能與梔子的炮制有關(guān)。對所標(biāo)定的18個共有的相對保留時(shí)間(RRT)和相對保留峰面積(RPA)分別進(jìn)行了分析，RRT的RSD小于1.5%，而RPA的RSD最高達(dá)到206.1%，且各相似度均大于0.95，由此可以認(rèn)為不同批次樣品中主要化學(xué)成分的組成相似，但相對比例存在明顯差異，這可能與梔子藥材的生長環(huán)境(產(chǎn)地、氣候、土壤等)、采收加工工藝和炮制工藝等諸多因素有關(guān)［13］。

2009—2011年產(chǎn)重慶后山梔子間相似度為0.977～0.998，平均相似度為0.991，RSD為0.67%，與梔子對照藥材的相似度(0.997)較為接近。連續(xù)3年采收的樣品間無明顯差異，不同類型(大、小類)具有高度的相似性與一致性，其結(jié)果提示重慶后山地區(qū)適宜梔子生長，且梔子的內(nèi)在質(zhì)量與其他產(chǎn)地間的梔子無顯著差異。

4.3 主成分分析所有的樣品被清晰地劃分為三大類(圖4)，S01～S17和S22被劃分為第Ⅰ類，主要為重慶后山梔子和梔子對照藥材;S23～S24為第Ⅱ類，為市售焦梔子;S19～S21為第Ⅲ類，為市售的商品梔子藥材。其主成分分析、相似度結(jié)果與實(shí)際收集的樣品情況基本一致，表明在該指紋圖譜識別模式下，主成分分析能較好地區(qū)分重慶后山梔子與其他產(chǎn)地梔子及炮制品焦梔子。主成分負(fù)載圖(圖4)表明，變量6(峰6，梔子苷)和變量11(峰11，西紅花苷-I)對主成分得分結(jié)果影響最大。其結(jié)果表明:環(huán)烯醚萜類成分梔子苷和西紅花苷類成分西紅花苷-1含有量比例的差異可能是造成不同樣品間差異的主要因素，這也是造成各主要共有峰RSD差異較大的主要原因。

4.4 基于UPLC-PDA技術(shù)，通過指紋圖譜結(jié)合化學(xué)統(tǒng)計(jì)方法(SA和PCA)對重慶后山梔子與梔子對照藥材和其他產(chǎn)地市售梔子藥材比較研究發(fā)現(xiàn):重慶后山梔子大、小果實(shí)級別間具有較高的相似度;三者間沒有顯著差異，且相似度均大于0.97，其主要差異表現(xiàn)在有效活性成分環(huán)烯醚萜類(梔子苷)和西紅花苷類(西紅花苷-I)的含有量上。

4.5 在前期研究工作中，對所收集的梔子樣品中主要藥效成分梔子苷和西紅花苷-I進(jìn)行定量分析:梔子對照藥材中梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.68 mg/g，西紅花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.42 mg/g;重慶后山梔子中梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.01～44.09 mg/g，西紅花苷-I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.07～4.01 mg/g;市售梔子中梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.38～45.47 mg/g，西紅花苷-I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.64～4.93 mg/g;市售焦梔子中梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.42～30.30 mg/g，西紅花苷-I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06～1.13 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重慶后山梔子與梔子對照藥材中主要藥效活性成分梔子苷與西紅花苷-1的含有量較為接近，而與市售的梔子及其焦梔子間存在一定差異，初步認(rèn)為這是造成指紋圖譜中所有樣本被劃分為三大類的主要原因。

4.6 本研究對合理評價(jià)與控制重慶后山梔子的內(nèi)在質(zhì)量奠定了一定的基礎(chǔ)，為當(dāng)?shù)厮幧痰牟缓侠硗茢鄺d子的質(zhì)量提供了參考依據(jù)，認(rèn)為重慶后山地區(qū)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境適宜梔子的生長，建議合理規(guī)范梔子的種植、提高梔子的品質(zhì)，從而來提高當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)收入，加快推進(jìn)重慶地區(qū)中藥特色經(jīng)濟(jì)發(fā)展的步伐。

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