RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定冠脈寧片中葛根素和丹酚酸B

程夏倩，張文婷，程維明，趙維良*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州310004)

冠脈寧片由丹參、血竭、葛根等十四味中藥組成，功能活血化瘀，行氣止痛，常用于以胸部刺痛、固定不移等為主癥的冠心病，心絞痛，冠狀動(dòng)脈供血不足［1］。該品全國(guó)共有25家企業(yè)生產(chǎn)，11個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有單獨(dú)控制葛根素或丹參素量或無(wú)定量控制。葛根素是葛根的主要有效成分之一，具有改善心腦血管循環(huán)、降低心肌耗氧量等多種藥理作用［2］。因此控制葛根素的含有量可以保障有效性的同時(shí)也可以從另一方面控制葛根的植物來(lái)源。丹參酚酸類成方是丹參主要有效成分，具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗血栓、改善血液循環(huán)等作用［3］，其中丹酚酸B量最高，且活性最強(qiáng)，選擇測(cè)定丹酚酸B作為質(zhì)量控制指標(biāo)具有重要意義;且《中國(guó)藥典》［4］中，丹酚酸B也是丹參藥材質(zhì)量控制指標(biāo)之一。目前對(duì)葛根素、丹酚酸B等成分研究文獻(xiàn)有較多報(bào)道［5-12］，本實(shí)驗(yàn)建立了RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定冠脈寧片中的葛根素和丹酚酸B，可為冠脈寧片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器HP1100系列高效液相色譜儀(G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣儀，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站)。

1.2 試藥葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)725-200108，定量測(cè)定用)，丹酚酸B對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111562-200605，定量測(cè)定用)，甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。冠脈寧片由12家生產(chǎn)企業(yè)提供共25批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，洗脫條件見(jiàn)表1;檢測(cè)波長(zhǎng):286 nm;柱溫:40℃;體積流量:1.0 mL/min。進(jìn)樣量:對(duì)照品10 μL、供試品10 μL，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算大于3 000。在此色譜條件下能達(dá)到很好分離，缺味樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode

圖1 冠脈寧片HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Guanmaining Tablets

2.2 對(duì)照品溶液制備精密稱取葛根素和丹酚酸B對(duì)照品適量，加50%甲醇分別制成每1 mL各含約95.95 μg和45.04 μg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備取本品10片(包衣者除去包衣)，研細(xì)，取0.25 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加50%甲醇適量，浸漬30 min后超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備分別取缺葛根藥材和缺丹參藥材的片劑，按照2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照樣品。

2.5 線性關(guān)系考察精密吸取上述葛根素對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、12、20 μL進(jìn)樣，上述丹酚酸B對(duì)照品溶液1、2、4、8、12、20、30、40 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以色譜峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程，葛根素的線性方程為Y=1.349 8X+1.862 5，r=1.000 0，丹酚酸B的線性方程為Y=1.084 6X－7.048 8，r=1.000 0，說(shuō)明葛根素在進(jìn)樣量0.048～1.919 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，丹酚酸B在進(jìn)樣量0.045～1.801μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)精密吸取葛根素和丹酚酸B對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果葛根素峰面積的RSD為0.2%，丹酚酸B峰面積的RSD為0.5%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品(廠家12，批號(hào):091101)6份，按供試品溶液制備方法制備，結(jié)果葛根素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.66 mg/g，RSD為0.4%，丹酚酸B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.63 mg/g，RSD為0.8%。

2.8 回收率試驗(yàn)精密稱取樣品(廠家12，批號(hào):091101)6份，分別精密加入葛根素對(duì)照品溶液和丹酚酸B對(duì)照品溶液適量，按正文供試品制備法制備，并依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，葛根素平均回收率為99.8%，RSD為1.5%，丹酚酸B平均回收率為108.8%，RSD為1.1%。

表2 冠脈寧片的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery test results of Guanmaining Tablets

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液和對(duì)照品溶液，在32 h內(nèi)，每間隔1、3、11、17個(gè)小時(shí)進(jìn)樣1次，進(jìn)樣體積為10 μL，結(jié)果對(duì)照品葛根素峰面積RSD為0.2%、供試品溶液為0.4%;對(duì)照品丹酚酸B峰面積RSD為0.4%、供試品溶液為0.5%，表明供試品溶液和對(duì)照品溶液在32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 樣品測(cè)定對(duì)收集到樣品的12家生產(chǎn)企業(yè)共25批冠脈寧片按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 冠脈寧片樣品測(cè)定結(jié)果(n=2)Tab.3 Content determ ination of Guanmaining Tablets(n=2)

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)考察了回流、超聲等提取方法，根據(jù)化合物的性質(zhì)，選擇50%甲醇為溶劑，由于丹參為水煎煮提取，葛根為生粉入藥，故選擇浸漬30 min后超聲提取30 min和回流提取30 min兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果葛根素量相當(dāng)，丹酚酸B用回流提取略低，考慮丹酚酸B對(duì)熱的不穩(wěn)定性，確定提取方法為超聲提取。此外，通過(guò)對(duì)溶媒種類(30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇)、超聲時(shí)間、溶液量等因素進(jìn)行考察，最后確定樣品的制備選擇取0.25 g樣品加25 mL 50%甲醇超聲提取30 min，該方法操作簡(jiǎn)便易行，且避免成分損失。

3.2 本實(shí)驗(yàn)中，比較了乙腈－0.005%三氟乙酸溶液、乙腈－0.05%磷酸溶液、乙腈－甲醇－0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相及不同洗脫條件，考察被測(cè)組分與雜質(zhì)峰的分離情況，最后選擇乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫分離度好;比較了Agilent Extend－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Therm Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，3種色譜柱所測(cè)得的樣品含有量偏差在3.0%以內(nèi)且3種色譜柱都有較好的分離度，同時(shí)還比較了20℃、30℃、40℃的柱溫對(duì)樣品進(jìn)行分析，不同柱溫下均有較好的分離且對(duì)含有量測(cè)定結(jié)果影響不大，葛根素RSD為2.3%，丹酚酸B RSD為1.1%。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)葛根素及丹酚酸B的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行了全面的考察，葛根素最大吸收波長(zhǎng)為250 nm、305 nm，丹酚酸B的最大吸收波長(zhǎng)為286 nm，考慮丹酚酸B相對(duì)于葛根素量較低，且在丹酚酸B最大吸收波長(zhǎng)處葛根素也能得到較好的分離，能完全滿足定量測(cè)定的要求，故確定測(cè)定波長(zhǎng)286 nm。

3.4 樣品測(cè)定結(jié)果分析測(cè)定結(jié)果顯示同一企業(yè)的不同批號(hào)產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果差異較小，但不同企業(yè)產(chǎn)品差異大。廠家3中葛根素含量最高，為10.29 mg/片;廠家8中葛根素含量最低，為0.59 mg/片;廠家2中丹酚酸B含量最高，達(dá)13.68 mg/片;廠家5中丹酚酸B含量最低，為0.53 mg/片。不同企業(yè)產(chǎn)品的葛根素含量差異大的原因可能與各企業(yè)投料的原藥材品種有關(guān)，12家生產(chǎn)企業(yè)中，4家使用粉葛投料，8家使用野葛投料，使用粉葛的廠家平均值為0.61 mg/片，而使用野葛的廠家平均值為3.09 mg/片，相差五倍之多。丹酚酸B含量測(cè)定結(jié)果相差較大的原因推測(cè)可能與丹酚酸B的不穩(wěn)定性以及生產(chǎn)工藝中加熱的參數(shù)不同有關(guān)。溫度、受熱時(shí)間、pH都是影響其穩(wěn)定性的重要因素［9］。因此，為避免市場(chǎng)流通的冠脈寧片不同廠家的質(zhì)量差異較大，建議各生產(chǎn)企業(yè)通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察，細(xì)化工藝參數(shù)，量化成品指標(biāo)，從而有效控制冠脈寧片的質(zhì)量。

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