HPLC法測(cè)定吳茱萸堿分散片中吳茱萸堿的含有量及其均勻度

盛蓉，宋英，呼梅，陳佳，朱璐璐

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610072;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610075)

吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.是臨床常用中藥，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽(yáng)止瀉之功效，用于寒滯肝脈諸通癥［1］。吳茱萸含有多種化學(xué)物質(zhì)，生物堿類是其主要生物活性成分，吳茱萸堿(Evodiamine)是吳茱萸生物堿類的代表成分［2］。課題組前期通過(guò)對(duì)我院治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效較好的中藥復(fù)方進(jìn)行拆方、大類成分、單一成分的逐步篩選，從中優(yōu)選出降尿酸作用較強(qiáng)的成分吳茱萸堿。已完成的藥效學(xué)研究表明，吳茱萸堿具有降尿酸、抑制尿酸鈉所致模型大鼠足腫脹、抗炎和鎮(zhèn)痛的作用，其中降尿酸作用為首次發(fā)現(xiàn)［3］。但吳茱萸堿為難溶性藥物，并且生物利用度偏低［4］，為提高其生物利用度及發(fā)揮其速釋效果，將其制備成分散片。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)，建立吳茱萸堿分散片中吳茱萸堿含有量和均勻度的測(cè)定方法，為制訂該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器HP1100型高效液相色譜儀(美國(guó)惠普)，四元泵，DAD檢測(cè)器，HP化學(xué)工作站;依利特C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);BP211D型分析天平(德國(guó)賽多利斯);AS10200超聲波清洗器(天津奧特賽斯儀器有限公司)。

1.2 試藥吳茱萸堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110802-200606);吳茱萸堿分散片(自制，批號(hào):120420、120421、120422);水為重蒸餾水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量測(cè)定

2.1.1 色譜條件依利特-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL磷酸溶液含2 mL四氫呋喃)(38:62);體積流量:1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5 μL。

2.1.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備精密稱取吳茱萸堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含34.5 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備取吳茱萸堿分散片20片，研細(xì)，取約0.05 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加適量甲醇超聲45 min(功率:150 W，頻率:33 kHz)，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

空白溶液的制備按吳茱萸堿分散片處方稱取輔料適量，按吳茱萸堿分散片的制備工藝和供試品溶液的制備方法制成空白溶液。

2.1.3 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、空白溶液和供試品溶液各5 μL，照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在與對(duì)照品溶液相同的保留時(shí)間，供試品溶液有相同的峰，而空白溶液無(wú)峰，說(shuō)明輔料對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)干擾。理論塔板數(shù)按吳茱萸堿計(jì)算不低于3 000，分離度大于1.5，見(jiàn)圖1。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取吳茱萸堿對(duì)照品溶液(0.034 5 mg/mL)0.5、1、3、5、10、15、20 μL分別進(jìn)樣，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積，以吳茱萸堿峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=10 239.641 7X+2.919 54(r=0.999 9)。結(jié)果表明，吳茱萸堿進(jìn)樣量在0.017 25～0.69 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 吳茱萸堿對(duì)照品(A)、供試品(B)和空白溶液(C)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substance(A)，sam p le(B)and blank solution(C)

2.1.5 精密度試驗(yàn)精密吸取吳茱萸堿對(duì)照品溶液5 μL，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，結(jié)果吳茱萸堿峰面積的RSD為0.696%(n=6)，精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品(批號(hào)120420)溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣5 μL，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果吳茱萸堿峰面積的RSD為0.373%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)取吳茱萸堿分散片(批號(hào)120420)適量，按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密量取5 μL，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算吳茱萸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，樣品中吳茱萸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.49%(n=6)，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)取同批吳茱萸堿分散片(批號(hào)120420)適量，研細(xì)，取約0.025 g，精密稱定，共6份，分別精密加入?yún)擒镙菈A對(duì)照品溶液(0.167 0 mg/mL)10 mL，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 吳茱萸堿分散片加樣回收率試驗(yàn)(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of evodiam ine(n=6)

結(jié)果平均回收率為98.45%，回收率在95%～105%之間，RSD值為1.40%，表明本法回收率良好。

2.2 樣品測(cè)定取3批樣品(批號(hào)120420、120421、120422)，每批3份，制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97.13%、97.62%、97.89%，RSD值分別為0.65%、0.84%、0.32%。

2.3 含有量均勻度［5］取3批樣品(批號(hào)120420、120421、120422)，每批10份，各取1片，精密稱定，置100 mL量瓶中，加適量甲醇超聲45 min(功率:150 W，頻率:33 kHz)，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按前述色譜條件分別測(cè)定含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 供試品提取溶劑的考察吳茱萸堿為常用中藥吳茱萸中吲哚喹啉類生物堿的重要成分［6］，溶于丙酮，略微溶于乙醇、乙醚及三氯甲烷，幾乎不溶于水、石油醚及苯，為難溶性藥物。試驗(yàn)中分別考察了丙酮、乙腈、甲醇和乙醇［7］作為提取溶劑對(duì)吳茱萸堿分散片中吳茱萸堿含有量測(cè)定的影響，結(jié)果以甲醇、丙酮作為提取溶劑吳茱萸堿溶解性均較好，但以丙酮為溶劑在吳茱萸堿峰處有干擾，故選擇甲醇為提取溶劑。

表2 吳茱萸堿分散片含有量均勻度(n=10)Tab.2 Results of content uniform ity of samples(n=10)

3.2 供試品提取時(shí)間的考察［8］分別考察超聲時(shí)間5、10、20、30、45、60 min(功率:150 W，頻率:33 kHz)對(duì)吳茱萸堿分散片中吳茱萸堿含有量測(cè)定的影響，結(jié)果超聲提取45 min時(shí)吳茱萸堿提取率較高，且與60 min的提取率無(wú)顯著性差異，所以超聲提取45 min即可。

3.3 流動(dòng)相的考察參考有關(guān)文獻(xiàn)［9-12］及2010年版《中國(guó)藥典》［1］，選用乙腈-0.1%磷酸(38∶62)與乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸(41∶59∶1∶0.2)為流動(dòng)相，均達(dá)到滿意的分離效果，吳茱萸堿峰基線分離，峰形對(duì)稱;但乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸(41∶59∶1∶0.2)作為流動(dòng)相時(shí)，吳茱萸堿峰保留時(shí)間太短，與溶劑峰出峰時(shí)間相隔太近，為避免溶劑峰的干擾，因此選擇乙腈-0.1%磷酸(38∶62)(每100 mL磷酸溶液含2 mL四氫呋喃)為流動(dòng)相，分離效果較佳。

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