Epac/Rap1信號(hào)通路在急性肺損傷中作用的研究進(jìn)展

汪雪峰，陳思煜，陳 鋒

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院1.藥劑科，2.放射科，浙江 杭州 310005)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一類臨床常見(jiàn)危重癥，嚴(yán)重威脅重癥患者的生命，病死率極高，達(dá)30% ～50%［1］。引起ALI的原因多種，其中以膿毒癥、重癥肺炎和嚴(yán)重創(chuàng)傷等為最主要原因。有研究表明，菌血癥或膿毒癥患者ARDS的發(fā)生率為18% ～38%，但病死率卻高達(dá)90%，是引起ARDS死亡的主要原因之一［2］;同時(shí)，膿毒癥休克中ARDS的發(fā)病率為37%，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)達(dá)到檢測(cè)水平的患者51%出現(xiàn)ARDS，而低于檢測(cè)水平的患者只有26%發(fā)展為ARDS，提示血中LPS水平?jīng)Q定ARDS發(fā)生的危險(xiǎn)性，LPS是引起ALI/ARDS的重要致病因子。

ALI致病因素多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。作為多種ALI致病因素的共同通路，肺損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)失調(diào)控在ALI疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵性作用已經(jīng)得到公認(rèn)［3］。隨著失控的炎癥反應(yīng)引發(fā)多器官功能紊亂綜合征理論的出現(xiàn)，對(duì)ALI的認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)向?qū)ρ装Y發(fā)生、調(diào)控，參與炎癥的炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子則成為研究的熱點(diǎn)，這些細(xì)胞和細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)構(gòu)成了ALI炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”和“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制為藥物治療提供了可能的靶點(diǎn)，對(duì)此也進(jìn)行了相當(dāng)多的探索。目前醫(yī)學(xué)界針對(duì)ALI中的相關(guān)通路研究逐漸增多，尤其cAMP活化交換蛋白Epac/Rap1這一信號(hào)通路正成為國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。本文就ALI/ARDS中氣道炎癥及Epac/Rap1信號(hào)通路在ALI中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 ALI/ARDS的病因及發(fā)病機(jī)制

ALI/ARDS病理特征是肺泡毛細(xì)血管屏障損傷、通透性增加而使富含蛋白的液體流入肺泡，引起肺不張，通氣/血流比例失調(diào)而導(dǎo)致呼吸衰竭。在LPS性ALI/ARDS中，LPS對(duì)微血管內(nèi)皮的直接損傷作用對(duì)疾病的發(fā)生也起到重要的作用。Anjum等［4］研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增高與F肌動(dòng)蛋白解聚密切相關(guān)，并且使肺腎上腺素受體出現(xiàn)明顯下調(diào)，顯示LPS對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接的損傷作用。Okajima等［5］發(fā)現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞可被直接激活，通過(guò)產(chǎn)生氧化亞氮和前列腺素，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)而損傷肺組織。LPS刺激30 min后，即可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞收縮，胞膜皺縮，細(xì)胞間連接松解，間裂形成，通透性增加。這種微血管通透性的增加出現(xiàn)在炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素 1(interleukin-1，IL-1)的血漿峰值及黏附分子表達(dá)之前?？梢?jiàn)，LPS可直接損傷肺泡毛細(xì)血管屏障引起ALI/ARDS的發(fā)生。

細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路的激活是ALI炎癥反應(yīng)的核心事件，炎癥信號(hào)通路的失調(diào)控以及炎癥因子平衡紊亂則是ALI發(fā)生和發(fā)展的重要原因。目前發(fā)現(xiàn)ALI發(fā)病過(guò)程中的多種理化因素刺激均能夠激活細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路。一些病原體源性物質(zhì)如LPS等能夠識(shí)別細(xì)胞膜上一類跨膜蛋白Toll樣受體而激活胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路［6］，并通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及相關(guān)受體造成肺損傷、抑制炎癥等是ALI/ARDS治療的主要作用手段。

2 Epac/Rap1信號(hào)通路在ALI中的作用機(jī)制

2.1 Epac/Rap1信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)

cAMP作為細(xì)胞內(nèi)第二信使對(duì)于正確轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的各種信息至關(guān)重要，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵因子。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，增高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平能明顯增加肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)性，改善凝血酶、LPS等多種因素引起的ALI/ARDS肺內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。一般認(rèn)為cAMP的絕大多數(shù)功能是通過(guò)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)實(shí)現(xiàn)的，但進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)PKA抑制劑(PKI)抑制cAMP依賴性蛋白激酶PKA，細(xì)胞內(nèi)高濃度的cAMP依然能發(fā)揮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［7］，提示cAMP非PKA依賴性信號(hào)通路的存在，這條新的信號(hào)通路參與高濃度的cAMP激活并產(chǎn)生與PKA相類似的效應(yīng)。

8-Pcpt-2'-O-Me-cAMP是cAMP的一個(gè)同源物，它可以特異地激活Epac，而不影響PKA的活性。利用這一人工合成物，研究者已將Epac蛋白定位在cAMP介入的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個(gè)非常重要的位置上。例如，Epac已被證明介入了細(xì)胞增殖過(guò)程;VE-/鈣黏素介導(dǎo)的細(xì)胞間的連結(jié)的形成過(guò)程;整合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞核基質(zhì)的附著過(guò)程;胰島素的分泌過(guò)程以及鈉質(zhì)子泵交換活性的調(diào)控過(guò)程。

2.2 Epac/Rap1信號(hào)通路與肺部炎癥

近期研究發(fā)現(xiàn)，Epac在調(diào)節(jié)肺部的氣道炎癥和細(xì)胞增殖方面是一個(gè)新的效應(yīng)器［10］，并且發(fā)現(xiàn)Epac在肺部的多種細(xì)胞中都有表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等，并在這些細(xì)胞的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如在大鼠肺纖維化模型中，Epac1呈先下降后升高趨勢(shì)，Epac2呈持續(xù)下降趨勢(shì)，提示 Epac可能參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［11］。

Epac作為Rap1特異的GEF，能直接與cAMP結(jié)合而被活化，進(jìn)而激活GTP酶 Rap1，通過(guò)Rap1途徑發(fā)揮許多生物學(xué)效應(yīng)。如激活的Rap1在整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附［12］、鈣黏素介導(dǎo)的細(xì)胞整合形成和內(nèi)皮細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)等多個(gè)過(guò)程中起作用［13-14］，Rap1的激活誘導(dǎo) Rac特定的 GEF小分子Tiam1和Vav2在細(xì)胞膜外圍聚集［12，15］，進(jìn)而激活小分子 GTP酶Rac，活化的Rac反過(guò)來(lái)刺激效應(yīng)信號(hào)激酶1型蛋白激酶A(protein kinase 1，PKA1)及細(xì)胞骨架，和細(xì)胞連接相關(guān)的下游效應(yīng)器，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的黏著斑和黏合帶的重排，增加單層EC的屏障功能［13，16-19］。Epac蛋白在這些細(xì)胞中如何表達(dá)以及外界刺激引起的機(jī)體病理生理的改變是否引起Epac的相應(yīng)的表達(dá)改變還不是很清楚，雖然已經(jīng)明確炎癥因子能夠改變Epac的表達(dá)，但具體機(jī)制也尚未研究清楚［20］。

Helms等［21］在研究頂膜和基底膜外側(cè)多巴胺對(duì)肺泡Ⅱ型細(xì)胞單層頂膜高選擇性鈉通道的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，多巴胺通過(guò)cAMP/Epac/Rapl途徑增加鈉通道開放率，增強(qiáng)ENaC活性，而非cAMP-PKA途徑，此途徑通過(guò)肺泡Ⅱ型細(xì)胞的多巴胺D1受體而不是β受體。實(shí)驗(yàn)中Cpt-2-O-Me-cAMP(能選擇性結(jié)合和激活Epac，而不激活PKA)可增加ENaC開放率，可被多巴胺 D1受體拮抗劑(SCH-23390)、Src抑制劑(PPP2)、PI3K抑制劑(LY-294002)、MEK 拮抗劑 U0126、磷脂酶A2抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑所阻斷;但不能被多巴胺D2受體拮抗劑、PKA抑制劑阻斷。同時(shí)cAMP-Epac-Rap1可激活DARPP32(多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白)，引起DARPP32磷酸化，阻斷多巴胺對(duì)ENaC活性，還通過(guò)MAPK途徑增強(qiáng)鈉泵活性，引起肺水清除增加。

2.3 Epac/Rap1信號(hào)通路在ALI發(fā)病中的作用

Epac的發(fā)現(xiàn)促使人們重新審視cAMP的不同生物學(xué)效應(yīng)的下游機(jī)制，Epac不僅能協(xié)同或拮抗PKA的作用，而且能獨(dú)立介導(dǎo)cAMP的生物學(xué)效應(yīng)。cAMP在體內(nèi)和體外能很明顯地誘導(dǎo)Epac對(duì)Rap1的鳥苷酸交換能力［22-25］，Birukova等［24］在機(jī)械通氣所導(dǎo)致的ALI模型中發(fā)現(xiàn)，伊洛前列素對(duì)ALI中受損的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的保護(hù)作用不僅僅是通過(guò)cAMP濃度升高激活PKA通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，還發(fā)現(xiàn)了非依賴PKA的新的信號(hào)通路Epac-Rap1-Tiam1/Vav2的存在。他們認(rèn)為，在凝血酶所導(dǎo)致的急性肺損傷模型中，Epac/Rap和PKA兩條信號(hào)通路也是同時(shí)存在的［23］，但在LPS和TNFα刺激誘導(dǎo)肺損傷動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)心鈉素能明顯提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，保護(hù)血管內(nèi)皮，基于前期其他模型中的研究，提示LPS和TNFα可能通過(guò)Epac/Rap1和 PKA兩條信號(hào)通路發(fā)揮作用，但是到目前為止，尚未證實(shí)在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中cAMP是否通過(guò)Epac/Rap1這條通路起作用。

在ALI中cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路參與并行使許多類型細(xì)胞的功能，包括細(xì)胞分泌、細(xì)胞間黏附和連接、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化等［26-27］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Epac/Rap1信號(hào)通路在多種類型細(xì)胞中都參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、整合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附等［28］。最近，Lyle等［29］報(bào)道 cAMP介導(dǎo)的Epac/Rap1在穩(wěn)定黏著斑的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的遷移和抑制細(xì)胞膜的突起，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的整合素之間的相互作用。有趣的是，最近的證據(jù)顯示，Epac和Rap蛋白可調(diào)節(jié)在鈣黏素重新分布的基礎(chǔ)上的內(nèi)皮細(xì)胞連接的形成。事實(shí)上，Epac和Rap調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、纖連蛋白的接觸和黏連，在多種細(xì)胞系中，這個(gè)過(guò)程涉及細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞間黏附與遷移的調(diào)制。Epac/Rap1信號(hào)通路與層連蛋白-5關(guān)系密切，因?yàn)閷舆B蛋白-5在肺部炎癥中是生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的侵入性生長(zhǎng)的一個(gè)顯著轉(zhuǎn)接器。更重要的是，EPAC參與的抗炎是通過(guò)抑制NF-κB和調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)，Epac/Rap1信號(hào)通路調(diào)節(jié)抑制因子-3和IL-6受體等。在LPS誘導(dǎo)的 ALI中，Epac通過(guò) PKB/Akt和 GSK-3減少IFN-β的產(chǎn)生［30］，但在肺泡巨噬細(xì)胞中并不改變巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)和MIP-1β的產(chǎn)生，然而，在RAW264.7細(xì)胞系中，小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中Epac的激活可增加前炎癥因子IL-1β和IL-6的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明，在不同的細(xì)胞類型中，Epac可增加或減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，但在這些不同類型的細(xì)胞中Epac/Rap1信號(hào)通路調(diào)節(jié)的炎癥機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)語(yǔ)

Epac是一類新的cAMP下游效應(yīng)分子，能與cAMP直接結(jié)合的GEF。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變?cè)贏LI中具重要地位，而Epac在肺血管通透性上起重要作用，有文獻(xiàn)報(bào)道Epac/Rap1通路介導(dǎo)PGE2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮通透性增加。我們前期在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中，采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Epac1在 LPS誘導(dǎo)的 ALI中表達(dá)是下調(diào)的，而Epac2在肺內(nèi)不表達(dá)(未發(fā)表)。提示 cAMP-Epac-Rap1-Tiam1/Vav2-Rac1在LPS誘導(dǎo)的ALI的發(fā)病機(jī)制中可能存在顯著的意義。

綜上所述，Epac/Rap1信號(hào)通路在ALI/ARDS發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)Epac-Rap1信號(hào)通路可能成為ALI/ARDS的治療新靶點(diǎn)，但是ALI/ARDS致病因素多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對(duì)于其中的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，研究證明多種相關(guān)蛋白質(zhì)和生物小分子均可參與信號(hào)調(diào)節(jié)，深入了解這些分子間的作用機(jī)制對(duì)于我們尋找最佳靶點(diǎn)、選擇合適的激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行疾病治療至關(guān)重要，有待于進(jìn)一步研究。

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