氧化應(yīng)激與肌萎縮側(cè)索硬化的關(guān)系

龔夢(mèng)妮 李小兵 徐仁伵 (南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)又稱路-蓋里格氏病，是以選擇性侵害上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，皮質(zhì)、腦干及脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性死亡為主要特征。在臨床上表現(xiàn)為肌無力、肌肉萎縮、肌束顫動(dòng)、反射亢進(jìn)、癱瘓等，最后由于呼吸肌萎縮，呼吸衰竭而死亡。根據(jù)其發(fā)病的遺傳特點(diǎn)常分為家族型 ALS(familial ALS，fALS)和散發(fā)型 ALS(sporadic ALS，sALS)。ALS的發(fā)病機(jī)制并不是單一獨(dú)立的因素造成，而是由多種復(fù)雜的因素相互作用所致，主要包括遺傳因素、氧化應(yīng)激、超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變、谷氨酸興奮毒性、線粒體功能異常、自身免疫異常、外源性毒素或病毒感染、神經(jīng)微絲的過磷酸化、神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏、細(xì)胞骨架異常以及蛋白質(zhì)異常聚積等〔1〕。雖然ALS的發(fā)病機(jī)制涉及很多方面，但氧化應(yīng)激在ALS的發(fā)病及病情進(jìn)展中的重要作用已引起廣泛關(guān)注。故此，本文就氧化應(yīng)激與ALS的關(guān)系作一綜述。

1 氧化應(yīng)激與抗氧化防御機(jī)制

氧化應(yīng)激是由于活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species，RNS)的產(chǎn)生和清除失衡引起〔2〕。氧化應(yīng)激可造成生物活性分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核酸等氧化修飾，使之喪失原有結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮，最后導(dǎo)致細(xì)胞的變性壞死。正常情況下，自由基并不引起機(jī)體的病理改變，因機(jī)體擁有對(duì)抗自由基損傷的酶，如SOD1、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、過氧化氫酶(CAT)及非酶體系防御系統(tǒng)，如非酶類抗氧化物類胡蘿卜素、生育酚和維生素 C以及游離金屬和血紅素結(jié)合蛋白。它們可中止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或?qū)⒆杂苫兂筛突钚晕镔|(zhì)，使自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡。如果自由基的產(chǎn)生超出機(jī)體的清除能力，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激〔3〕。

2 ALS氧化損傷的證據(jù)

腦組織是機(jī)體氧化代謝最活躍的器官，腦組織具有較低的抗氧化劑含量、高密度的膜不飽和脂肪酸、較高的氧化代謝率以及依賴完整的神經(jīng)元突觸傳遞。與其他組織相比，極易被氧化，特別易于遭受ROS介導(dǎo)的損傷。研究表明，自由基與DNA、蛋白質(zhì)和脂類反應(yīng)后的氧化產(chǎn)物可以作為反映自由基水平或者氧化應(yīng)激的標(biāo)志物〔4〕。

8-羥基-2-脫氧鳥苷酸(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是ROS氧化損傷細(xì)胞核DNA或線粒體DNA后形成的產(chǎn)物。目前機(jī)體8-OHdG水平已被廣泛接受為評(píng)價(jià)DNA氧化損傷的標(biāo)志物，通過8-OHdG的檢測(cè)可以評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化損傷和修復(fù)的程度、氧化應(yīng)激與DNA損傷的相互關(guān)系，并用來估計(jì)氧化應(yīng)激與疾病的相關(guān)性〔5〕。Mitsumoto等〔6〕學(xué)者通過對(duì)比 50個(gè)sALS受試者與46個(gè)陰性對(duì)照者來研究氧化應(yīng)激生物標(biāo)記，運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測(cè)尿液，發(fā)現(xiàn)8-oHdG的水平在sALS受試者中明顯升高;同時(shí)應(yīng)用ELISA和HPLC/ECD(high-pressure liquid chromatography coupled with electrochemical detection)這兩種技術(shù)從同一尿樣中檢測(cè)8-oHdG水平，發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)sALS中氧化應(yīng)激標(biāo)記物上調(diào)。

蛋白質(zhì)氧化損傷標(biāo)志物蛋白質(zhì)碳基產(chǎn)物在sALS病人的脊髓和運(yùn)動(dòng)皮層中明顯增高。Siciliano等〔7〕檢測(cè)了49例ALS患者和8名對(duì)照者腦脊液(CSF)和血漿中氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)含量，鐵生成能力(FRA)，在CSF中還檢測(cè)了2個(gè)氧化產(chǎn)物〔4-羥基壬烯酸(HNE)、總亞硝酸鹽和硝酸鹽〕含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FRA在ALS的CSF中是降低的，AOPP在血漿和CSF中均升高。AOPP含量在不同ALS臨床類型中不同，在總的ALS患者和ALS脊髓型中升高，在ALS延髓型中幾乎測(cè)不出。在ALS中HNE、總亞硝酸鹽和硝酸鹽與正常人中無差異。

過氧化脂質(zhì)的代謝產(chǎn)物亦產(chǎn)生毒性作用。HNE是脂質(zhì)過氧化物中最重要的一種產(chǎn)物。活檢ALS和正常人腰髓和皮層，發(fā)現(xiàn)ALS患者HNE可以使谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋(EAAT2)修飾失活，這提示HNE可以促進(jìn)ALS患者的神經(jīng)元變性。Shibata等〔8〕用免疫組化和定量酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等方法，測(cè)得 ALS病人和轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織中HNE免疫反應(yīng)的增強(qiáng)，也提示脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物HNE參與了ALS的發(fā)病機(jī)制。

2.1 SOD1基因突變與ALS 1993年Rosen等在18個(gè)ALS家系中發(fā)現(xiàn)ALS1與SOD1基因緊密連鎖，首次在13個(gè)ALS1連鎖家系中發(fā)現(xiàn)11種SOD1基因突變，從而證實(shí)SOD1基因?yàn)锳LS1的疾病基因。2007年Gruzman等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)在SOD1基因突變的fALS和sALS患者中都檢測(cè)出一種含有SOD1免疫反應(yīng)的蛋白，表明在fALS和sALS的發(fā)病機(jī)制中有共同的部分。

SOD1基因定位于21q22.11，基因組DNA全長11kb，含有5個(gè)外顯子，編碼一種153個(gè)氨基酸的SOD1蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn)突變SOD1蛋白具有一些特性:(1)突變SOD1的構(gòu)象不穩(wěn)定，自身就容易發(fā)生折疊;(2)突變SOD1自身的構(gòu)象存在著錯(cuò)誤折疊;(3)低聚化的突變SOD1蛋白在體外能夠形成淀粉樣纖維，并且突變SOD1蛋白之間可以借助側(cè)鏈相互接觸;(4)突變SOD1蛋白的溶解度下降。

突變SOD1蛋白的毒性作用機(jī)制有:(1)氧化應(yīng)激損傷增加，在fALS動(dòng)物模型中，突變SOD1被糖基化后可形成更多的過氧化氫(H2O2)，加重細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷;(2)興奮性毒性增加，Hu等研究發(fā)現(xiàn)在突變SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)減少了，導(dǎo)致細(xì)胞外的谷氨酸濃度增加，引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡;并且在ALS患者的血液和CSF中也存在谷氨酸濃度隨病情進(jìn)展而升高的現(xiàn)象;(3)啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡，突變SOD1在早期可激活基質(zhì)金屬蛋白酶1(Caspase-1)，觸發(fā)前白介素-1β的分泌引起緩慢的細(xì)胞凋亡，而在后期可進(jìn)一步激活Caspase-3直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔10〕;(4)蛋白合成障礙，有研究認(rèn)為突變的SOD1影響賴氨酸(Lysyl)-tRNA合成酶而導(dǎo)致線粒體蛋白合成功能障礙，進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡〔11〕。

2.2 微量元素銅、鐵與ALS 銅是具有氧化還原活性的動(dòng)物必需的微量元素，它以酶的催化基團(tuán)或結(jié)構(gòu)輔因子的形式參與多種功能活動(dòng)，如電子傳遞、氧合與催化等〔12〕。銅容易得失電子，即使在低濃度情況下也具有很強(qiáng)的毒性。銅離子是SOD1活性中心的重要組成部分，SOD1催化超氧陰離子歧化為氧氣和H2O2。H2O2被催化產(chǎn)生大量的高活性和高毒性的羥自由基，羥自由基在體內(nèi)是最具損傷性的自由基，能使線粒體電子傳遞系統(tǒng)受損、胞內(nèi)鈣平衡紊亂、蛋白酶作用加強(qiáng)、膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。G93A-mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)羥自由基水平的升高。當(dāng)SOD1沒有結(jié)合Zn2+時(shí)，SOD1中的Cu2+將一個(gè)電子傳遞給O2形成超氧陰離子，與NO反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)氧化劑過亞硝酸鹽(ONOO-)。SOD1突變體(mSOD1)的Cu2+易暴露于蛋白分子的結(jié)構(gòu)外，而與ONOO-生成過亞硝酸鹽，后者使其他蛋白質(zhì)的酪氨酸硝基化，引起后續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)受阻。小鼠模型中給予Cu2+螯合劑如曲恩汀和D-鹽酸青霉胺，在發(fā)病初和疾病進(jìn)程中表現(xiàn)出保護(hù)效應(yīng)。延緩了fALS-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病、延長了其生存期，阻止了表達(dá)有SOD1突變細(xì)胞的死亡。這也證實(shí)銅離子介導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與了 ALS的發(fā)病機(jī)制。

游離狀態(tài)的鐵可通過Haber-Weiss反應(yīng)催化ROS形成，比如超氧陰離子和H2O2在鐵催化下生成羥自由基，造成氧化應(yīng)激。ALS病人的CSF中有輕度的鐵水平升高。用激光微探針質(zhì)譜法對(duì)5例sALS病人尸檢后的頸髓標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)sALS病人頸髓神經(jīng)元的胞漿和胞核中的鐵比對(duì)照組高出1.5～2倍，認(rèn)為脊髓組織中過量的鐵催化了活性氧的產(chǎn)生，可能在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。用蛋白序列方法研究發(fā)現(xiàn)SOD1-G93A小鼠晚期與對(duì)照組小鼠相比，脊髓勻漿中鐵蛋白重鏈表達(dá)增加，說明鐵穩(wěn)態(tài)的改變?cè)贏LS發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。給SOD1-G93A小鼠腹膜內(nèi)注射鐵卟啉，不論是早期給藥還是癥狀出現(xiàn)時(shí)再給藥(與患者開始治療的時(shí)間類似)都能明顯改善SOD1-G93A小鼠的運(yùn)動(dòng)功能、延長其存活期，經(jīng)鐵卟啉治療的SOD1-G93A小鼠脊髓中丙二醛(脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物)、蛋白羰基(蛋白氧化的標(biāo)志物)水平明顯下降，神經(jīng)元存活增加。這一結(jié)果進(jìn)一步提供了在ALS小鼠中氧化損傷參與發(fā)病機(jī)制的證據(jù)。

2.3 線粒體功能障礙與ALS 氧化應(yīng)激在老化過程中伴有關(guān)鍵的作用，并且與線粒體功能障礙有關(guān)。新近研究〔13〕發(fā)現(xiàn)ALS患者和轉(zhuǎn)基因ALS小鼠模型的神經(jīng)與骨骼肌組織均存在線粒體形態(tài)和功能異常，通過興奮鈣離子通道途徑減低呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ的活性，從而導(dǎo)致能量代謝障礙，提示線粒體功能障礙與ALS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前的多項(xiàng)研究〔14，15〕顯示，線粒體功能障礙是ALS發(fā)生、發(fā)展的重要因素。Zhou等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，散發(fā)型ALS患者的肝和脊髓前角細(xì)胞中有線粒體形態(tài)異常，骨骼肌活檢發(fā)現(xiàn)線粒體體積增大、Ca2+濃度增高、線粒體功能受損?；驒z測(cè)發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA異常，推測(cè)ALS的線粒體功能障礙是由于其自身缺陷引起的，而非繼發(fā)于失神經(jīng)支配。Muller等〔17〕對(duì)SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠研究中發(fā)現(xiàn)在去神經(jīng)支配7 d后，骨骼肌細(xì)胞線粒體ROS水平近30倍增高，去神經(jīng)支配萎縮肌纖維與線粒體ROS有關(guān)，ROS增高可能導(dǎo)致線粒體功能障礙。ALS患者骨骼肌中線粒體復(fù)合體Ⅳ活性下降，肌肉線粒體蛋白表達(dá)降低，線粒體解耦聯(lián)蛋白3的表達(dá)上調(diào)，這提示ALS本身存在骨骼肌線粒體功能障礙。

2.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞與ALS 星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種主要細(xì)胞。它們不僅是對(duì)神經(jīng)元具有結(jié)構(gòu)上的支持和營養(yǎng)之外，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的完整性方面具有重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過清除細(xì)胞外的谷氨酸和鉀參與了離子平衡，并且與神經(jīng)元和其他膠質(zhì)細(xì)胞通過相互作用來進(jìn)行信息交流〔17～19〕。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)代謝過程起重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞直接和間接參與了多種神經(jīng)變性疾病損傷的病理過程。在內(nèi)外因素的作用下，退行性病變的神經(jīng)元以及過度激活的膠質(zhì)細(xì)胞將導(dǎo)致神經(jīng)元所處微環(huán)境的惡化，使神經(jīng)元的損傷進(jìn)行性加重〔18～20〕。

ALS發(fā)病中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷使NO和過氧化亞硝酸鹽產(chǎn)生增加，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生氧化應(yīng)激，致使?fàn)I養(yǎng)因子缺乏，促使SOD1突變，導(dǎo)致神經(jīng)元的退化。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)可能是一個(gè)程序化的現(xiàn)象。有研究顯示，CSF中的毒性因素刺激了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。在星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的高峰出現(xiàn)時(shí)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元便開始了它的死亡。臨床發(fā)作時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生開始增加，同時(shí)伴有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中大量線粒體空泡化。臨床發(fā)作后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的量越多，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性就越加重。于此同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ALS轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型和患者的脊髓尤其在圍繞受損的上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的皮質(zhì)脊髓束周圍均發(fā)現(xiàn)明顯的膠質(zhì)細(xì)胞增生。這些活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞有共同點(diǎn):①星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度與神經(jīng)元的退變相關(guān)，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失之前即發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元周圍出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，表明是病變神經(jīng)元介導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。②SOD1包涵體不僅出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中還大量出現(xiàn)于周圍膠質(zhì)細(xì)胞中，表明各種細(xì)胞均存在蛋白折疊和處理功能障礙。③星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)程度與炎性因子、ROS、氮的表達(dá)增加和谷氨酸穩(wěn)態(tài)失常有關(guān)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元具有更強(qiáng)的抗氧化能力。有證據(jù)表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌谷胱甘肽到細(xì)胞外間隙可增加共培養(yǎng)神經(jīng)元的抗氧化防御能力，從而保護(hù)神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf-2-ARE)通路激活劑特丁基對(duì)苯二酚(Tert-butylhydroquinone，tBHQ)可顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞谷胱甘肽的合成和分泌，抑制神經(jīng)生長因子受體p75(p75NTR)依賴的共培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡。應(yīng)用II相酶誘導(dǎo)劑干預(yù)ALS體外器官型脊髓培養(yǎng)模型，可激活 Nrf-2-ARE通路，誘導(dǎo)醌氧化還原酶1(Quinone oxidoreductase1，QOR1)、血紅素氧合酶1(Hemeoxygenase-1，HO-1)等表達(dá)上調(diào)，降低氧化應(yīng)激水平，對(duì)蘇羥天冬氨酸誘導(dǎo)的選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷具有明顯保護(hù)作用〔21〕。此外，SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞選擇性過表達(dá)Nrf-2可以增加神經(jīng)元的抗氧化損傷能力，推遲 SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠起病時(shí)間，延長生存期〔22〕。

3 ALS的抗氧化治療

利魯唑是第一個(gè)獲美國FDA和歐盟批準(zhǔn)用于治療ALS的藥物。它不僅能抑制神經(jīng)末端谷氨酸的釋放，還能直接抑制蛋白激酶C，通過抗氧化損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從中國綠茶中提取的一種高效、無毒的抗氧化劑，具有很強(qiáng)的清除自由基抗氧化的功效，并可以誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化酶的表達(dá)，對(duì)包括ALS在內(nèi)的神經(jīng)變性疾病有保護(hù)作用。它的抗氧化機(jī)制包括:清除ROS;螯合鐵離子;激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng);抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

丙酮酸酯作為抗氧化劑和能量的來源，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。丙酮酸酯能減輕硝基酪氨酸免疫反應(yīng)及膠質(zhì)增生，增加Bcl-2的表達(dá)，用丙酮酸酯治療G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠其生存期延長12.3 d，并可以改善其運(yùn)動(dòng)功能〔23〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為谷胱甘肽前體具有很強(qiáng)的抗氧化作用。用NAC治療ALS的動(dòng)物研究中，發(fā)現(xiàn)NAC可延緩SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性，且可提高GSH的含量，清除ROS，延長小鼠的生命。在隨機(jī)，雙盲及安慰劑對(duì)照的研究中，也發(fā)現(xiàn)NAC對(duì)ALS病人的病程有明顯影響，顯示出NAC對(duì)ALS有保護(hù)作用的趨勢(shì)。此外，乙酰水楊酸鹽、β-胡蘿卜素、維生素E、維生素C等抗氧化劑都具有一定程度的抗氧化治療效果。

4 展望

綜上所述，在ALS病理機(jī)制的眾多學(xué)說中，目前沒有得到公認(rèn)的學(xué)說，各種機(jī)制可能都反映了疾病過程的某一階段或經(jīng)過?？傊?，氧化應(yīng)激在ALS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，但這方面的工作仍處于起步階段，亟待深入研究。隨著人們對(duì)ALS病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡述，研究者對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變的更深層次的認(rèn)識(shí)，使ALS患者得到早期診斷、早期治療，以延長患者的生命，提高患者的生活質(zhì)量，以致治愈。

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