蛋白磷酸酶1與Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究進(jìn)展

廖儒佳，曹雯雯，張 偉

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 226001)

心肌疾病是指除心臟瓣膜病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心肌病、高血壓心臟病、肺源性心肌病、先天性心血管病和甲狀腺功能亢進(jìn)性心肌病等以外的以心肌病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的一組疾病，癥狀常表現(xiàn)為心力衰竭。1995年世界衛(wèi)生組織和國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)(WHO/ISFC)工作組根據(jù)病理生理學(xué)將心肌病分為四型，即擴(kuò)張型心肌病(dilated crdiomyopathy，DCM)、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)、限制型心肌病(restrictive cardiomyopathy，RCM)及致心律失常型右室心肌病(arryhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)。但不定型的心肌病(unclassified cardiomyopathies，UCM)仍保留。隨著研究的發(fā)展此分類已顯示出很多缺陷，2006年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)新定義心肌病為由各種病因主要是遺傳因素引起的一組非均質(zhì)的心肌病變，包括心臟機(jī)械和電活動(dòng)的異常。心肌病可以單純局限于心臟，也可以是全身系統(tǒng)性疾病的一部分，最終導(dǎo)致心力衰竭或死亡［1］。

目前心肌病的分子和細(xì)胞生物學(xué)研究取得了較大進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)DCM由心肌結(jié)構(gòu)蛋白如肌動(dòng)蛋白、α-原肌球蛋白等突變所致，采用候選基因篩查和連鎖分析策略已定位26個(gè)染色體位點(diǎn)與該病相關(guān)，并已從中成功鑒定出22個(gè)致病基因［2］。HCM是由多種編碼心肌肌小節(jié)的收縮蛋白質(zhì)基因突變引起的，已將其致病基因定位在9個(gè)不同的染色體上，至少15種HCM致病相關(guān)基因及450種以上致病性基因突變，且已確認(rèn)11種基因突變與該病有關(guān)［2］。RCM較少見(jiàn)，有報(bào)道肌鈣蛋白I的突變可引起限制性及肥厚型心肌病［3］。目前ARVC的研究認(rèn)為其系第8號(hào)染色體上4個(gè)基因突變所致，分別是蘭尼堿受體(Ryanodine receptor，RyR)、代司莫普拉肯、Plakophillin-2和轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β調(diào)節(jié)基因［2］。

1 PP1的相關(guān)研究

目前研究顯示蛋白磷酸酶家族包含 PP1、PP2A、PP3 (PP2B/calcineurin)、PP4、PP5、PP6與PP7，而PP1、PP2A和PP3是研究最深入的3種蛋白磷酸酶，其中PP1與PP2A是許多細(xì)胞內(nèi)最豐富的蛋白磷酸酶，尤其PP1在心肌細(xì)胞肥厚與心力衰竭的病理生理中發(fā)揮極其重要的作用［4］，已發(fā)現(xiàn)終末期心力衰竭病人的PP1表達(dá)明顯增加［5］，而其內(nèi)源性抑制劑及其下游的調(diào)控蛋白的表達(dá)明顯下降［6］。PP1(35-38 ku)是最保守的真核生物蛋白質(zhì)之一，其作為一種重要的蛋白磷酸酶參與細(xì)胞許多重要生理功能，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、調(diào)控Ca2+-ATPase活性等。

1.1 PP1的結(jié)構(gòu)與分布 真核生物基因組有1～8個(gè)基因是編碼PP1，哺乳動(dòng)物有3個(gè)PP1基因，分別編碼PP1α，PP1γ和 PP1β/δ亞型，這些亞型被廣泛表達(dá)且它們約有0.89的相似氨基酸序列，這些亞型主要不同之處是其N端與C端［7-8］。1995年Goldberg等［9］首次報(bào)道了PP1催化亞基的三維結(jié)構(gòu)，從分子水平上看，其全酶由1個(gè)固定的催化亞基(具有磷酸化的活性)和估計(jì)多達(dá)100個(gè)調(diào)控亞基組成的異二聚體。1997年Egloff等［10］研究了PP1γ的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其催化亞基環(huán)繞周圍形成3個(gè)凹槽，分別為:酸性凹槽(acidic groove)、疏水凹槽(hydrophobic groove)和C端凹槽(C-terminal groove)。3個(gè)凹槽形成Y字型結(jié)構(gòu)，其兩臂之間夾著一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)區(qū)，即β12/β13 loop，該環(huán)是同族絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的共有結(jié)構(gòu)，研究表明該區(qū)域?yàn)橐种苿┙Y(jié)合區(qū)。從細(xì)胞水平上看、PP1α在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有分布，且聚集于未知核小體中，PP1γ在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有分布，且聚集于核仁中，PP1β/δ則在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均廣泛分布［11］。從組織水平上看，PP1α、PP1γ和PP1β/δ在哺乳動(dòng)物組織中廣泛分布于腦、肝、骨骼肌、腎、小腸、心臟、肺等，其中PP1α除在心臟和骨骼肌的表達(dá)水平太低無(wú)法檢測(cè)外，在其它組織均有分布;PP1γ則在腦、小腸和肺中表達(dá)最高;PP1β/δ除在骨骼肌的表達(dá)水平太低無(wú)法檢測(cè)外在其它組織也有分布［12］。值得注意的是PP1α與PP1γ在心臟中的表達(dá)極低，而 PP1β/δ表達(dá)則相對(duì)較高，因此可以推測(cè)PP1β/δ亞型在心肌疾病的發(fā)生與發(fā)展中可能起重要作用。事實(shí)上3種亞型中目前發(fā)現(xiàn)只有PP1β/δ在心衰的心臟中表達(dá)明顯升高，且其主要是通過(guò)調(diào)控肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)中受磷蛋白(phospholamban，PLN)的絲氨酸16位磷酸化調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Ca2+，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能［13］。研究顯示心肌組織特異性的過(guò)表達(dá)PP1β/δ shRNA，抑制PP1β/δ的表達(dá)，能明顯改善心衰心臟中SR中Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡［14］。

1.2 PP1與心肌病 PP1是心臟功能重要的負(fù)調(diào)控蛋白，在心臟中PP1作為主要的磷酸酶負(fù)責(zé)SR中PLN去磷酸化，而PLN主要參與SR中Ca2+-ATPase活性的調(diào)控，PLN在去磷酸化狀態(tài)能抑制Ca2+-ATPase活性，PLN偶聯(lián)β腎上腺素受體磷酸化其蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的絲氨酸16和CaMKⅡ上的蘇氨酸17位點(diǎn)能減輕其抑制作用，進(jìn)而增加Ca2+進(jìn)入SR的量，增加心肌收縮力［15］。已發(fā)現(xiàn)PP1的活性在心衰病人中增加導(dǎo)致PLN磷酸化減少，因此減少了Ca2+-ATPase的活性，并抑制了PLN誘導(dǎo)SR中Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，從而影響心肌細(xì)胞功能;有趣的是，RyR在心衰病人心臟中高度磷酸化，從而導(dǎo)致Ca2+依賴的活性增加并進(jìn)一步減少SR中Ca2+負(fù)荷。因此，心肌細(xì)胞SR中PLN磷酸化的減少與RyR磷酸化程度增加這個(gè)自相矛盾的兩方面可能反映了激酶與磷酸酶在微環(huán)境中的復(fù)雜作用，也反映了PP1在心臟中復(fù)雜的調(diào)控作用［4］。

一組研究通過(guò)小鼠模型證實(shí)心臟中過(guò)度表達(dá)PP1(3倍)導(dǎo)致心臟收縮功能減弱，引起擴(kuò)張型心肌病和過(guò)早死亡［15］，而過(guò)表達(dá)PP1抑制劑1和2(inhibitor 1 or 2 of protein phosphatase 1，Inh-1，Inh-2)均能有效地抑制心肌肥厚和心衰的發(fā)生/發(fā)展，并可以逆轉(zhuǎn)由于PP1過(guò)表達(dá)引起的心肌肥厚和心功能缺失［16-20］。Rajashree等［21］發(fā)現(xiàn)PP1通過(guò)磷酸化心肌細(xì)胞的肌球蛋白輕鏈2潛在的引起心肌等長(zhǎng)張力增加0.2～0.3，而過(guò)度磷酸化導(dǎo)致心肌肥厚。Singh等［22］發(fā)現(xiàn)蛋白激酶 A固著蛋白(A-kinase anchoring protein 18，AKAP18)通過(guò)直接影響Inh-1調(diào)節(jié)PP1的活性參與調(diào)控心肌功能。而有研究認(rèn)為熱休克蛋白20(small heat shock protein 20，HSP20)增強(qiáng)心肌基礎(chǔ)功能的主要原因在其能抑制PP1活性［23］。因此越來(lái)越多的證據(jù)表明設(shè)法抑制PP1活性已成為心肌病的潛在治療方案。然而目前對(duì)這一觀點(diǎn)還存在部分疑問(wèn)。Grote-Wessels等［24］就報(bào)道了過(guò)表達(dá)Inh-2并沒(méi)有使小鼠心功能在壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中發(fā)生改善，事實(shí)上Inh-2過(guò)表達(dá)反而加速了心功能惡化。作者推測(cè)這是因?yàn)殚L(zhǎng)期過(guò)表達(dá)Inh-2而長(zhǎng)期抑制PP1活性，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，而惡化心功能。因此考慮到PP1是一種在整個(gè)機(jī)體中作用廣泛的蛋白，短期抑制PP1活性，不管是通過(guò)表達(dá)其內(nèi)源性抑制蛋白Inh-1與Inh-2或應(yīng)用外源性抑制劑如tautomycetin都能改善心功能，但如果長(zhǎng)期維持勢(shì)必對(duì)心功能產(chǎn)生不良影響。但什么情況下長(zhǎng)期表達(dá)、什么時(shí)候用短期治療，這個(gè)度怎么判斷，目前來(lái)看還是一個(gè)問(wèn)題。其次為什么長(zhǎng)期表達(dá)會(huì)發(fā)生PP1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，它的調(diào)控機(jī)制是什么，也是未來(lái)值得研究的方向。此外由于外源性的PP1阻斷劑能同時(shí)阻斷蛋白磷酸酶2A(PP2A，一種同族的蛋白去磷酸化酶，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮性)活性，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此開(kāi)發(fā)PP1特異性抑制藥，也成為未來(lái)研究的焦點(diǎn)。

2 CaMKⅡ的相關(guān)研究

目前Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶家族(Ca2+/calmodullin-dependent protein kinase，CaM Kinase)包括 CaMKⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅢ和CaMKⅣ。除CaMKⅢ主要調(diào)控延胡索酸2外，其余3種Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶均是多功能蛋白激酶。CaMKⅠ是一種單體酶，主要位于細(xì)胞質(zhì)，但其C末端截?cái)嘈问揭材苻D(zhuǎn)位到細(xì)胞核磷酸化并激活一系列的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)其在心臟組織也有表達(dá)，但在心肌肥厚的病理變化中卻并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)增加，因此其在心肌疾病中的作用還有待進(jìn)一步研究。CaMKⅣ也是一種單體酶，目前發(fā)現(xiàn)其主要分布于神經(jīng)元、T淋巴細(xì)胞及睪丸，在心臟中還沒(méi)有檢測(cè)到。CaMKⅣ主要位于細(xì)胞核中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控及基因表達(dá)中起重要作用。CaMKⅡ(-600 KD)是一種同源或異源的多體酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的心臟、骨骼肌、肺、肝臟、胰腺、視網(wǎng)膜、腎、甲狀旁腺、乳腺、子宮等。研究顯示CaMKⅡ作為一種重要的蛋白激酶主要參與與Ca2+信號(hào)有關(guān)的細(xì)胞功能調(diào)控，包括氨基酸和脂質(zhì)代謝、離子通道/受體及神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、細(xì)胞骨架蛋白和Ca2+平衡等。它是心臟中最主要的CaM Kinase亞型，CaMKⅡ在心臟中發(fā)揮了極其重要的功能，特異性過(guò)表達(dá)CaMKⅡ在心臟中或離體心肌細(xì)胞中均能明顯調(diào)控興奮收縮耦聯(lián)作用［25］。

2.1 CaMKⅡ的結(jié)構(gòu)和分布 CaMKⅡ全酶由3個(gè)關(guān)鍵區(qū)域組成的亞單位構(gòu)成，這3個(gè)區(qū)域分別是:連接區(qū)-與復(fù)合體直接相連;調(diào)控區(qū)-控制酶的活性和自動(dòng)抑制作用;催化區(qū)-行使CaMKⅡ功能。目前研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ有超過(guò)30個(gè)由可變剪接產(chǎn)生的亞型，但其在心臟中研究最廣泛的是分別由4種不同的基因(α、β、γ、δ)編碼的亞型，并且目前發(fā)現(xiàn)很多可變剪接產(chǎn)生的亞型都可歸入這4種亞型細(xì)分亞型。神經(jīng)組織中主要表達(dá)CaMKⅡα和CaMKⅡβ，嚙齒類海馬中CaMKⅡα和CaMKⅡβ占到總蛋白量的0.2。CaMKⅡγ和CaMKⅡδ則幾乎在機(jī)體的所有組織中表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物心臟中主要是CaMKⅡδ亞型，并且主要是CaMKⅡδA、 CaMKⅡδB、CaMKⅡδC 3種，這3種亞型由于其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞定位不同而發(fā)揮不同功能。其中CaMKⅡδB的可變區(qū)1中包含一個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的核定位信號(hào)，因此主要位于細(xì)胞核，其主要涉及心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)基因表達(dá)的調(diào)控，且它似乎也是成人心臟中最主要的CaMKⅡ亞型。而CaMKⅡδC由于缺乏核定位信號(hào)而主要位于細(xì)胞質(zhì)中。CaMKⅡδB在心肌肥大基因的表達(dá)中具有重要作用，在心臟及心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CaMKⅡδB能保護(hù)心臟免受缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷［26］，且在CaMKⅡδB轉(zhuǎn)基因小鼠中，CaMKⅡδB的過(guò)表達(dá)促進(jìn)心肌肥厚基因的表達(dá)，如myocyte enhancer factors(MEF2)和 histone deacetylase 4(HDAC4)等，最終引起心肌肥厚和心力衰竭［27-28］。CaMKⅡδC通過(guò)磷酸化一系列Ca2+調(diào)控蛋白而影響興奮收縮偶聯(lián)，在CaMKⅡδC轉(zhuǎn)基因小鼠中，因CaMKⅡδC過(guò)度表達(dá)激活胞質(zhì)內(nèi)的RyR2，使得Ca2+過(guò)度釋放，而導(dǎo)致心臟電-機(jī)械活動(dòng)異常，心肌過(guò)度肥厚，并造成擴(kuò)張性心肌病和心力衰竭，且過(guò)表達(dá)CaMKⅡδC會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［29］。CaMKⅡδA不含核定位信號(hào)，主要分布在心臟細(xì)胞T管區(qū)，最初發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元表達(dá)［30］，后發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于新生心肌細(xì)胞，且一個(gè)月后其表達(dá)逐漸消失［31］。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)表達(dá)CaMKⅡδA能增強(qiáng)興奮收縮偶聯(lián)引起的心肌過(guò)度收縮而誘導(dǎo)心衰，此外，其活性上調(diào)伴隨著心肌細(xì)胞增大，肌原纖維重構(gòu)且激活一系列心肌肥大基因如ANF及肌球蛋白重鏈［27，32］。

2.2 CaMKⅡ與心肌病 心臟組織主要表達(dá)CaMKⅡδ亞型，分布在心肌細(xì)胞T管終未池、肌漿網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核等，通過(guò)磷酸化數(shù)種Ca2+調(diào)節(jié)蛋白，如RyR、phospholamban、L-型鈣通道、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶等調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電興奮收縮偶聯(lián)。另外，CaMKⅡδ也參與基因表達(dá)長(zhǎng)期調(diào)節(jié)(電興奮-轉(zhuǎn)錄調(diào)控)，而參與各種內(nèi)外源性刺激引起的心臟細(xì)胞肥大性生長(zhǎng)，肌節(jié)結(jié)構(gòu)重組及胚胎基因表達(dá)，最終引起心肌肥厚而導(dǎo)致心力衰竭。CaMKⅡδ過(guò)度激活導(dǎo)致心肌細(xì)胞RyR2功能異常，引起靜息狀態(tài)下細(xì)胞中Ca2+通過(guò)RyR從SR漏出到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，使Ca2+濃度升高，SR鈣儲(chǔ)備量下降，使心臟收縮時(shí)從SR釋放的Ca2+減少，而影響心肌收縮力，并相應(yīng)增加心臟舒張時(shí)SR的Ca2+量，易導(dǎo)致延遲后去極化等心率失常發(fā)生。CaMKⅡ的激活還伴隨著細(xì)胞內(nèi)氧化態(tài)改變，并上調(diào)與CaMKⅡ有關(guān)的組成性激活突變基因酶，此類酶參與心肌病中多個(gè)病理通路包括激活一類影響心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)及細(xì)胞生存的酶如離子通道、調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)的蛋白及與炎癥基因表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子等［33-34］。

無(wú)論在多種原因引起的終末期心肌病病人，還是在結(jié)構(gòu)性心肌病的動(dòng)物模型心臟中，CaMKⅡδ蛋白含量和活性均升高，而選擇性地抑制心臟CaMKⅡδ則減輕多種模型心肌病變和心力失常，改善心肌收縮。Zhang等［35］通過(guò)應(yīng)用小鼠心肌CaMKⅡδ抑制模型證實(shí)抑制CaMKⅡδ能夠極大地阻止βAR過(guò)度表達(dá)和心肌梗死。Satoru等［36］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CaMKⅡ影響了一系列鈣調(diào)控蛋白導(dǎo)致Ca2+穩(wěn)態(tài)被破壞進(jìn)而增加活性氧的量。Respress等［37］發(fā)現(xiàn)在心衰的病人及小鼠模型中CaMKⅡ主要磷酸化RyR2絲氨酸2814位點(diǎn)進(jìn)而導(dǎo)致Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡。CaMKⅡ磷酸化RyR2導(dǎo)致心衰的發(fā)展還跟心衰的類型有關(guān)系，只有在非局部缺血導(dǎo)致的心衰病人或壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心衰中CaMKⅡ磷酸化RyR2調(diào)控Ca2+的穩(wěn)態(tài)，且選擇性敲除RyR2的絲氨酸2814位點(diǎn)明顯延緩心衰的進(jìn)程。與此相反，局部缺血導(dǎo)致的心衰病人或急性心肌梗死小鼠模型中卻并沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象。因此，CaMKⅡδ的激活在心肌肥厚和重構(gòu)中起重要作用，它可能成為臨床治療心肌肥厚和心力衰竭的重要靶蛋白。因此抑制CaMKⅡδ的過(guò)度激活已經(jīng)成為心肌病潛在的治療靶點(diǎn)。但目前關(guān)于β-腎上腺素是否直接激活CaMKⅡδ還不清楚，目前只觀察到部分β-腎上腺素對(duì)興奮收縮偶聯(lián)的作用由CaMKⅡδ調(diào)控，且雖然有各種CaMKⅡδ抑制劑如KN-93和KN-62等，但目前臨床相關(guān)的CaMKⅡ抑制劑還不存在。

3 PP1與CaMKⅡ在心肌病治療中的比較。

綜上所述，PP1與CaMKⅡ是一對(duì)去磷酸化與磷酸化蛋白質(zhì)。雖然它們都是多功能蛋白酶，且都具有廣泛的生理作用，但在調(diào)節(jié)心臟功能中，都是直接或間接參與對(duì)第二信使Ca2+的調(diào)控。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與心臟收縮和舒張功能密切相關(guān)，早期心肌細(xì)胞Ca2+濃度升高可使心肌收縮性加強(qiáng)，但Ca2+濃度持續(xù)升高將導(dǎo)致舒張功能障礙。此外胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高還會(huì)引起一系列蛋白功能改變，進(jìn)一步使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加，形成惡性循環(huán)，造成Ca2+超載，Ca2+超載可啟動(dòng)Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并參與心肌肥厚的發(fā)生/發(fā)展。因此對(duì)心肌病的治療其中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)就是調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)。在心肌病治療中雖然單獨(dú)抑制PP1或者CaMKⅡ均能改善細(xì)胞中Ca2+的穩(wěn)態(tài)，但對(duì)PP1與CaMKⅡ的調(diào)控可能不能只單獨(dú)抑制某一種，未來(lái)的治療策略應(yīng)該綜合考慮兩者的情況，同時(shí)加以調(diào)控。并且現(xiàn)在關(guān)于PP1與CaMKⅡ之間是否存在相互調(diào)節(jié)作用還有待研究?？梢韵胂笕绻鼈冎g存在著相互調(diào)節(jié)，那么對(duì)這一通路進(jìn)行調(diào)控應(yīng)該更具有應(yīng)用價(jià)值。

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